一种材小蠹属昆虫基因条形码检测试剂盒及其检测方法与流程

文档序号:11148141阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种材小蠹属昆虫基因条形码检测试剂盒,其特征在于:用于快速检测材小蠹属昆虫,该试剂盒包括基因条形码序列盘和引物试剂,所述的引物试剂的序列如下:

上游引物C1-J-2183:5,-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3,

下游引物TL2-N-3014:5,-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3,

所述基因条形码序列盘存有37条标准条码序列,其序列见基因序列表中序列3-序列39所示。

2.根据权利要求所述的材小蠹属昆虫基因条形码检测试剂盒,其特征在于:该试剂盒还包括下列试剂:Taqbuffer,MgC12,dNTPmix,TaqDNA聚合酶,ddH2O,DNA模板。

3.根据权利要求1所述的材小蠹属昆虫基因条形码检测试剂盒,其特征在于:所述的小蠹属昆虫为12种,分别为:赤材小蠹、阔面材小蠹、单刻材小蠹、细点材小蠹、对粒材小蠹、伴随材小蠹、暗翅材小蠹、四粒材小蠹、北方材小蠹、伪材小蠹、双齿材小蠹和栗粒材小蠹。

4.一种利用权利要求1所述的材小蠹属昆虫基因条形码检测试剂盒检测材小蠹属昆虫的方法,其特征在于,包括以下步骤:

(一)DNA的提取;提取步骤如下:

(1)将待检虫体放入适量蒸馏水中,适当晃动,将虫体内的酒精置换出来,然后将虫体置于吸水纸上吸干虫体体表的水分;

(2)将虫体放入离心管中,用小杵研磨;加入100μL pH8.3的CTAB分离缓冲液,研磨,再加入100μL上述分离液缓冲液中,继续研磨,直至研磨充分;

(3)加入200μL pH8.3的CTAB分离缓冲液,漩涡混匀,加入3μL 20mg/mL Pro-k,轻柔混和,55℃保温3-5小时,直到组织完全解体,离心管中液体清亮为止;

(4)13000rpm离心10分钟,取上清液置于离心管中;

(5)加等体积的25:24:1的酚:氯仿:异戊醇抽提,上下颠倒十次,13000rpm离心5分钟,重复抽提1-2次,直至水相与有机相界面处几乎看不到白色的蛋白质为止;

(6)取上清液于新离心管,加入等体积-20℃异丙醇,颠倒混合沉淀DNA,-20℃冰箱沉淀过夜或-70℃冰箱放置1-2小时;形成白色絮状DNA沉淀;12000rpm离心10-20分钟;

(7)弃上清液;将沉淀用500μL -20℃的70%乙醇溶液清洗,10000 rpm离心5分钟,倾去液体,洗涤2次,将离心管倒置于吸水纸上晾干;

(8)沉淀晾干后,溶解于20-30μL的TE溶液中,-20℃保存;

(二)PCR反应条件与反应体系:

PCR反应总体积为50μL,含1U Taq聚合酶,反应缓冲液,2.5mmol/L MgCl2,0.25mmol/L dNTP,50ng 上游引物C1-J-2183,50ng TL2-N-3014TL2-N-3014,模板NDA为2 μL;

在200 μL的薄壁管中依次加入如上体系,混合均匀,置于PCR仪进行PCR反应,扩增条件如下:94℃变性45s,51℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环;反应前94℃预变性3min,反应后72℃延伸5min;

(三)PCR结果判定:

扩增反应结束后,将PCR特异性扩增产物在1%琼脂糖胶上进行电泳检测;电泳结束后,将凝胶置于紫外分析仪上观察,并用凝胶成像仪拍照后记录结果;

照片显示材小蠹与标准DNA样品在450bp位置有清晰的扩增条带;即为目标条带;

(四)PCR产物测序获得基因序列,得到待测材小蠹测序的序列;

(五)材小蠹属昆虫基因比对:

将待测材小蠹测序得到的序列与基因条形码序列盘中标准基因条码序列进行比对,结果按以下方式运行:

(1)与标准基因条码序列相似度100%,则认定其为该种类;

(2)没有与任何标准条码序列相似度达100%,则将待测材小蠹基因序翻译为氨基酸,与标准基因条码序列所对应的氨基酸序列比对计算遗传距离,与未知种类材小蠹基因序列遗传距离小于2%的标准基因条码种类,即为目标种类;当遗传距离都大于2%,判定未知材小蠹种类不在此12种材小蠹范围内。

5.根据权利要求4所述的材小蠹属昆虫基因条形码检测试剂盒检测材小蠹属昆虫的方法,其特征在于,步骤(五)材小蠹属昆虫基因比对中:没有与任何标准条码序列相似度达100%,则将待测材小蠹基因序列按“无脊椎动物密码子”翻译为氨基酸,与标准基因条码序列所对应的氨基酸序列使用“P-distance模型”计算遗传距离,与未知种类材小蠹基因序列遗传距离小于2%的标准基因条码种类,即为目标种类;当遗传距离都大于2%,判定未知材小蠹种类不在此12种材小蠹范围内。

6.根据权利要求4所述的材小蠹属昆虫基因条形码检测试剂盒检测材小蠹属昆虫的方法,其特征在于,步骤(三)PCR结果判定中:将PCR特异性扩增产物在含有0.5ug/mL EB Free的1%琼脂糖胶上进行电泳检测。

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