用于预测前列腺癌的基于全血的MRNA标记物和检测该MRNA标记物的方法与流程

文档序号:13426315
本文提供了用于预测前列腺癌的基于全血的mRNA生物标记和检测该mRNA生物标记的方法。具体地讲,本发明所公开的mRNA标记物和方法允许检测患者的全血样本中的前列腺癌特异性mRNA生物标记,辨别患有前列腺癌的患者,辨别患有高危前列腺癌的患者,以及治疗患有前列腺癌的患者。

背景技术:
前列腺癌是美国男性中第二常见的癌症。它也是所有种族和西班牙裔出身人群中男性癌症死亡的主要原因之一。2010年,美国有196,038名男性被诊断为患有前列腺癌,而美国有28,560名男性死于前列腺癌。(美国癌症统计工作组,美国癌症统计:1999–2010,基于Web的发病率和死亡率报表,亚特兰大(GA)卫生和人类服务部,疾病预防和控制中心和美国国家癌症协会(U.S.CancerStatisticsWorkingGroup.UnitedStatesCancerStatistics:1999–2010IncidenceandMortalityWeb-basedReport.Atlanta(GA):DepartmentofHealthandHumanServices,CentersforDiseaseControlandPrevention,andNationalCancerInstitute);2013)。控制前列腺癌的主要挑战之一是缺乏这样的测试:区分开应当充分治疗以阻止攻击性疾病的那些患者,以及应当避免无痛性疾病的过度治疗的那些患者。前列腺癌的分子异质性和从患者采集肿瘤组织的困难性使得个体化控制前列腺癌很困难。

技术实现要素:
本文公开了检测患者的全血样本中的前列腺癌特异性mRNA生物标记的方法。该方法包括、由和/或基本上由如下过程组成:从全血样本中分离RNA;从所分离的RNA合成cDNA;以及测量至少一种mRNA生物标记的表达水平,其中所述至少一种mRNA生物标记是或者选自基本上由以下项组成的组:KLK3、ACADL、GRHL2、HOXB13、HSD3B1、TMP.ERG、ARv7(ARV3.7)、ARV567、FOLH1、KLK2、HSD3B2、AGR2、AZGP1、STEAP2、KCNN2、GPX8、SLCO1B3、TMEFF2、SPINK1、SFRP4、NROB1、FAM13C、HNF1A、CDH12、PGR、PITX2、MYBPC1、FOXA1、SRD5A2、COL1A1、NPY、UGT2B17、CLUL1、C9orf152、FLNC、GPR39、RELN、THBS2、CYP17A1、CYP3A5、BRS3、SNAI2、CDH12、NKX3.1、LGR5、TRPM8、SLCO1B3和/或它们的任何组合。本发明还公开了用于检测患者的全血样本中ARv7(ARV3.7)的方法。该方法包括、由和/或基本上由如下过程组成:从全血样本中分离RNA,从所分离的RNA合成cDNA,以及测量ARv7(ARV3.7)的表达水平。本发明还公开了辨别患有前列腺癌的患者的方法,该方法包括、由和/或基本上由如下过程组成:从患者的全血样本获得cDNA;使cDNA与基因芯片接触,其中基因芯片包含COL1A1的引物对和探针;测量COL1A1的表达水平;以及将COL1A1的表达水平与COL1A1的参考水平进行比较,其中全血样本中COL1A1的表达水平相比于参考水平提高指示前列腺癌。本发明还提供了辨别患有高危前列腺癌的患者的方法。该方法包括、由和/或基本上由如下过程组成:从患者的全血样本中获得cDNA;使cDNA与基因芯片接触,其中基因芯片包含指示高危前列腺癌的至少一种mRNA生物标记的引物对和探针,其中至少一种mRNA生物标记包括、由和/或基本上由选自以下的成员组成:KLK3、PGR、KCNN2、MYBPC1、HOXB13、COL1A1、GPX8、FAM13C、SLCO1B3、KLK2、TMEFF2、NROB1、PITX2、ACADL、SFRP4、AGR2、HNF1A、GRHL2和/或它们的任何组合;测量至少一种mRNA生物标记的表达水平;以及将至少一种mRNA生物标记的表达水平与至少一种mRNA生物标记的参考水平进行比较,其中至少一种mRNA生物标记的表达水平相比于参考水平提高指示高危前列腺癌。此外,还可将mRNA生物标记组合成包括多种mRNA生物标记在内的生物标记组。如果例如3、4、5、6、7、8、或9种生物标记检测出大于或等于预定值,则受检者称为生物标记阳性。生物标记阳性状态指示高危前列腺癌。本发明还公开了治疗患有前列腺癌的患者的方法,该方法包括、由和/或基本上由如下过程组成:从患者的全血样本获得cDNA;使cDNA与基因芯片接触,其中基因芯片包含COL1A1的引物对和探针;测量COL1A1的表达水平;将COL1A1的表达水平与COL1A1的参考水平进行比较;以及如果COL1A1的表达水平相比于COL1A1的参考水平有所提高,则对前列腺癌患者进行治疗。该示例并不意在限制例如mRNA生物标记的表达,或者本文所述的生物标记阳性状态也可用于选择患者进行治疗。本发明还提供了用于检测患者的全血样本中的前列腺癌特异性mRNA转录物的基因芯片,该基因芯片包含、由和/或基本上由引物对和探针组成,所述引物对和探针被构造成能够扩增和检测选自以下项的成员:KLK3、ACADL、GRHL2、HOXB13、HSD3B1、TMP.ERG、ARV3.7、ARV567、FOLH1、KLK2、HSD3B2、AGR2、AZGP1、STEAP2、KCNN2、GPX8、SLCO1B3、TMEFF2、SPINK1、SFRP4、NROB1、FAM13C、HNF1A、CDH12、PGR、PITX2、MYBPC1、FOXA1、SRD5A2、COL1A1、NPY、UGT2B17、CLUL1、C9orf152、FLNC、GPR39、RELN、THBS2、CYP17A1、CYP3A5、BRS3、SNAI2、CDH12、NKX3.1、LGR5、TRPM8、SLCO1B3和/或它们的任何组合。附图说明当结合附图阅读时,可进一步理解发明内容以及下文的具体实施方式。为了说明所公开的方法和基因芯片,在附图中示出了该方法和基因芯片的示例性实施方案,但是该方法和基因芯片并不限于所公开的具体实施方案。在附图中:图1表示COL1A1的示例性ROC曲线,显示出在标记表达的所有水平下敏感性和特异性之间的折衷。点指示使敏感性和特异性最大化的最佳切分点。图2表示生物标记或生物标记组的示例性Kaplan-Meier曲线,显示出x-轴上所示的特定时间未经历例如疾病复发或疾病所致的死亡类事件的受检者的比例。生物标记阳性和生物标记阴性受检者分别由红线和黑线表示。与生物标记阴性受检者相比,生物标记阳性受检者更早经历事件的可能性显著更高,即生物标记阳性受检者的预后更差。具体实施方式结合对形成本公开一部分的附图,并参考下文的具体实施方式,可更容易地理解所公开的方法和基因芯片。应当理解,所公开的方法和基因芯片并不限于本文所述和/或所示的具体方法和基因芯片,并且本文所用的术语仅用于以举例方式描述具体实施方案,不旨在限制受权利要求保护的方法和基因芯片。除非另外特别说明,否则关于可能的机制或作用模式或改善原因的任何描述仅旨在出于示例性目的,并且本发明所公开的方法不受任何此类建议的机制或作用模式或改善原因的正确或错误的约束。提及具体数值至少包括该具体值,除非上下文另有明确规定。当表示值的范围时,另一个实施例包括从一个具体的值和/或到其他具体的值。此外,提及以范围形式表述的值时,包括该范围内的每个值。所有范围都是指闭区间并且可以组合。当前面用“约”将数值表示为近似值时,应当理解,该具体值构成了另一个实施方案。应当理解,为清楚起见,所公开的方法和基因芯片的某些特征在单独实施方案的上下文中进行描述,但也可以组合形式在单个实施方案中提供。相反地,为简明起见,所公开的方法和基因芯片的各种特征在单个实施方案的上下文中进行描述,但也可单独提供或以任何子组合形式提供。如本文所用,单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。如本文所用,术语“患者”是指全血样本可使用所公开方法进行分析的任何哺乳动物。因此,所公开的方法适用于人类和非人类受检者,但其最优选地用于人类。在一些实施方案中,患者样本是人类样本。在其他实施方案中,患者样本是非人类样本。“患者”和“受检者”在本文中可互换使用。如本文所用,短语“使cDNA与基因芯片接触“是指借此将获自患者全血样本的cDNA与基因芯片一起温育或添加到基因芯片中以评估基因表达的方法。短语“表达水平提高”涵盖存在mRNA生物标记以及mRNA生物标记相对于参考样本的水平提高这两者。例如,一种或多种公开的mRNA生物标记可能不存在于参考样本中。对于此类mRNA生物标记,术语“表达水平提高”是指在患者的全血样本中存在mRNA生物标记。相反地,一种或多种公开的mRNA生物标记可能以某种水平存在于参考样本中。对于此类mRNA生物标记,术语“表达水平提高”是指患者的全血样本中的mRNA生物标记的水平相比于参考样本有所提高。如本文所用,“参考样本”是指来自于不具有并且过去不具有前列腺癌的个体或个体群的全血样本。因此,“……的参考水平”是指来自于不具有并且过去不具有前列腺癌的个体或个体群的全血样本中的一种或多种所公开的生物标记的表达水平。如本文所用,“引物对”是指用于扩增所关注的mRNA生物标记的cDNA的正向引物和反向引物。前列腺癌特异性mRNA生物标记的检测本文公开了检测患者的全血样本中的前列腺癌特异性mRNA生物标记的方法。该方法包括:从全血样本中分离RNA;从所分离的RNA合成cDNA;任选地预扩增cDNA,以及测量至少一种mRNA生物标记的表达水平,其中至少一种mRNA生物标记是KLK3、ACADL、GRHL2、HOXB13、HSD3B1、TMP.ERG、ARV7(ARV3.7)(也称为ARV7)、ARV567、FOLH1、KLK2、HSD3B2、AGR2、AZGP1、STEAP2、KCNN2、GPX8、SLCO1B3、TMEFF2、SPINK1、SFRP4、NROB1、FAM13C、HNF1A、CDH12、PGR、PITX2、MYBPC1、FOXA1、SRD5A2、COL1A1、NPY、UGT2B17、CLUL1、C9orf152、FLNC、GPR39、RELN、THBS2、CYP17A1、CYP3A5、BRS3、SNAI2、CDH12、NKX3.1、LGR5、TRPM8、SLCO1B3、或它们的任何组合。本发明所公开的方法允许检测全血样本中的前列腺癌特异性mRNA生物标记。这些标记物的检测可用于辨别/诊断患有前列腺癌的患者,辨别患有/预测患有高危前列腺癌的患者,以及治疗患有前列腺癌的患者。如本文所用,短语“前列腺癌特异性mRNA生物标记”是指可用于从全血样本检测前列腺癌的单一mRNA生物标记或mRNA生物标记组(即两个或更多个相关的生物标记)。示例性mRNA生物标记列于表1中并且包括但不限于KLK3、ACADL、GRHL2、HOXB13、HSD3B1、TMP.ERG、ARV3.7、FOLH1、KLK2、HSD3B2、AGR2、AZGP1、STEAP2、KCNN2、GPX8、SLCO1B3、TMEFF2、SPINK1、SFRP4、NROB1、FAM13C、HNF1A、CDH12、PGR、PITX2、MYBPC1、FOXA1、SRD5A2、COL1A1、NPY、UGT2B17、CLUL1、C9orf152、FLNC、GPR39、RELN、THBS2、CYP17A1、BRS3、SNAI2、CDH12、NKX3.1、LGR5、TRPM8、SLCO1B3和CYP3A5。表1—示例性mRNA生物标记合适的mRNA生物标记可功能性分类为雄激素控制类、醋酸阿比特龙抗性类、神经内分泌旁路类、或其它旁路路径。因此,在一些实施方案中,至少一种mRNA生物标记可为雄激素控制类、醋酸阿比特龙抗性类、神经内分泌旁路类、其它旁路路径、或它们的任何组合的成员。全血的表达谱提供优于肿瘤组织的表达谱的几个实用优点,包括样本采集的微创性质、相对容易的标准化采样规程、以及能够随时间获得重复样本,原因是肿瘤组织不被视为护理标准的一部分。全血样本可通过本领域已知的多种技术(包括但不限于静脉穿刺)从患者获取。可将全血样本采集到采血管中。在一些实施方案中,采血管可为牌血液RNA管。用于从全血样本中分离RNA的技术在本领域中是已知的。合适的市售试剂盒包括例如QIAGENPAXgeneBloodRNA试剂盒,其规程在实施例部分中有所描述。用于从分离的RNA合成cDNA的技术在本领域中是已知的,包括但不限于对RNA逆转录。在一些实施方案中,可在合成步骤之后预扩增cDNA。预扩增步骤可进行任何合适的循环数。循环数部分依赖于起始cDNA的量和/或进行扩增步骤所需的cDNA的量。合适的预扩增循环数包括但不限于1至20个循环。因此,预扩增步骤可进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个循环中的任一种。在一些方面,预扩增步骤可进行2个循环。在其它方面,预扩增步骤可进行14个循环。在其它方面,预扩增步骤可进行多于20个循环。测量至少一种mRNA生物标记的表达水平包括扩增cDNA并用基因芯片检测所扩增的cDNA,其中基因芯片包含以下项的引物对和探针:KLK3、ACADL、GRHL2、HOXB13、HSD3B1、TMP.ERG、ARV3.7、ARV567、FOLH1、KLK2、HSD3B2、AGR2、AZGP1、STEAP2、KCNN2、GPX8、SLCO1B3、TMEFF2、SPINK1、SFRP4、NROB1、FAM13C、HNF1A、CDH12、PGR、PITX2、MYBPC1、FOXA1、SRD5A2、COL1A1、NPY、UGT2B17、CLUL1、C9orf152、FLNC、GPR39、RELN、THBS2、CYP17A1、CYP3A5、BRS3、SNAI2、CDH12、NKX3.1、LGR5、TRPM8、SLCO1B3、或它们的任何组合。在一些方面,基因芯片可包含每种待分析mRNA生物标记的一种引物对和一种探针。在其它方面,基因芯片可包含每种待分析mRNA生物标记的多于一种引物对和多于一种探针。尽管无意于受理论的束缚,但添加到基因芯片中的预扩增的cDNA将被对所关注mRNA生物标记内的区域具有特异性的引物对结合并扩增。随着cDNA被扩增,所扩增的cDNA将被对所关注mRNA生物标记内的区域具有特异性的探针结合。当扩增过程发生时,探针与扩增的cDNA结合将允许检测扩增的cDNA。因此,本发明所公开的方法允许在扩增过程的早期检测至少一种mRNA生物标记的表达水平,使得敏感性和精确性增强。测量步骤可在预扩增或未预扩增的cDNA上进行。可例如通过qRT-PCR进行cDNA扩增。合适的试剂和条件对本领域的技术人员是已知的。qRT-PCR可在多种合适的平台上进行。在一些方面,例如,qRT-PCR可使用FluidigmTM进行。因此,在一些实施方案中,测量步骤可包括在FluidigmTM平台上通过qRT-PCR用FluidigmTM基因表达芯片扩增cDNA,其中基因表达芯片包含如上所讨论的至少一种mRNA生物标记。本发明还公开了用于检测患者的全血样本中ARV7(ARV3.7)的方法。本发明所公开的方法包括从全血样本中分离RNA,从所分离的RNA合成cDNA,并且测量ARV3.7的表达水平。在一些实施方案中,可在合成步骤之后预扩增cDNA。合适的预扩增循环数包括但不限于1至20个循环。因此,预扩增步骤可进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个循环。在一些方面,预扩增步骤可进行2个循环。可将全血样本采集到采血管中,例如血液RNA管。测量步骤可使用包含ARV3.7的引物和探针的任一种公开的基因芯片进行。在一些实施方案中,测量步骤可使用包含SEQIDNO:2的正向引物和SEQIDNO:3的反向引物的基因芯片进行。在一些方面,基因芯片还可包含SEQIDNO:1的探针。检测ARV7(ARV3.7)表达的方法还可包括将来自患者的全血样本的ARV7(ARV3.7)的表达水平与ARV7(ARV3.7)表达的参考水平进行比较。ARV7(ARV3.7)表达的合适的参考水平包括例如未患前列腺癌的个体的全血样本中ARV7(ARV3.7)的参考水平。比较步骤可用于确定来自患者的全血样本的ARV7(ARV3.7)的表达水平是否相对于ARV7(ARV3.7)表达的参考水平有所提高或降低。辨别患有前列腺癌的患者的方法本文还公开了辨别患有前列腺癌的患者的方法。本发明所公开的方法包括:从患者的全血样本获得cDNA;使cDNA与基因芯片接触,其中基因芯片包含COL1A1的引物对和探针;测量COL1A1的表达水平;以及将COL1A1的表达水平与COL1A1的参考水平进行比较,其中全血样本中COL1A1的表达水平相比于参考水平提高指示前列腺癌。cDNA可通过从全血样本中分离RNA并从所分离的RNA合成cDNA而获自全血样本。用于分离RNA和合成cDNA的合适技术包括以上所公开的那些并且进一步公开于实施例部分中。在一些实施方案中,可在合成步骤之后对cDNA进行预扩增。预扩增步骤可进行任何合适的循环数,包括但不限于1至20个循环。因此,预扩增步骤可进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个循环。在一些方面,预扩增步骤可进行14个循环。在一些实施方案中,基因芯片还包含至少一种附加mRNA生物标记的引物对和探针,其中至少一种附加mRNA生物标记是KLK3、ACADL、GRHL2、HOXB13、HSD3B1、TMP.ERG、ARV3.7、ARV567、FOLH1、KLK2、HSD3B2、AGR2、AZGP1、STEAP2、KCNN2、GPX8、SLCO1B3、TMEFF2、SPINK1、SFRP4、NROB1、FAM13C、HNF1A、CDH12、PGR、PITX2、MYBPC1、FOXA1、SRD5A2、NPY、UGT2B17、CLUL1、C9orf152、FLNC、GPR39、RELN、THBS2、CYP17A1、CYP3A5、BRS3、SNAI2、CDH12、NKX3.1、LGR5、TRPM8、SLCO1B3、或它们的任何组合。在基因芯片包含至少一种附加mRNA生物标记的引物对和探针的实施方案中,该方法还包括:测量至少一种附加mRNA生物标记的表达水平;以及将至少一种附加mRNA生物标记的表达水平与至少一种附加mRNA生物标记的参考水平进行比较,其中至少一种附加mRNA生物标记的表达水平相比于参考水平提高指示前列腺癌。在一些方面,基因芯片可包含每种待分析mRNA生物标记的一种引物对和一种探针。在其它方面,基因芯片可包含每种待分析mRNA生物标记的多于一种引物对和多于一种探针。在基因芯片还包含至少一种附加mRNA生物标记的引物对和探针的实施方案中,该方法包括:测量COL1A1和至少一种附加mRNA生物标记的表达水平;以及将COL1A1和至少一种附加mRNA生物标记的表达水平与COL1A1和至少一种附加mRNA生物标记的参考水平进行比较。例如,并且不旨在进行限制,在一些实施方案中,还方法可包括:使cDNA与基因芯片接触,其中基因芯片包含COL1A1的引物对和探针和MYBPC1的引物对和探针;测量COL1A1和MYBPC1的表达水平;以及将COL1A1和MYBPC1的表达水平与COL1A1和MYBPC1的参考水平进行比较,其中全血样本中COL1A1和MYBPC1的表达水平相比于参考水平提高指示前列腺癌。测量单独的或与至少一种附加mRNA生物标记结合的COL1A1的表达水平包括:采用单独的或与至少一种附加mRNA生物标记的引物结合的COL1A1的引物对来扩增cDNA,并且采用单独的或与至少一种附加mRNA生物标记的探针结合的COL1A1的探针对扩增的cDNA进行检测。测量步骤可在预扩增或未预扩增的cDNA上进行。可例如通过qRT-PCR进行cDNA扩增。合适的试剂和条件对本领域的技术人员是已知的。qRT-PCR可在多种合适的平台上进行。在一些方面,例如,qRT-PCR可使用FluidigmTM进行。因此,在一些实施方案中,测量步骤可包括在FluidigmTM平台上通过qRT-PCR用FluidigmTM基因表达芯片扩增cDNA,其中基因表达芯片包含如上讨论的单独的或与至少一种附加mRNA生物标记的引物结合的COL1A1的引物。可将全血样本采集到采血管中,包括但不限于PAX基因RNA管。辨别患有前列腺癌的患者的方法还可包括通过实时PCR确认至少一种mRNA生物标记的表达水平。在一些实施方案中,该方法还可包括将危险因子指派给前列腺癌,其中KLK3、PGR、KCNN2、MYBPC1、HOXB13、或它们的任何组合的表达水平提高指示高危前列腺癌。辨别患有高危前列腺癌的患者的方法本发明还公开了辨别患有高危前列腺癌的患者的方法。该方法包括:从患者的全血样本获得cDNA;使cDNA与基因芯片接触,其中基因芯片包含引物对和指示高危前列腺癌的一组mRNA生物标记,其中该组mRNA生物标记包括:KLK3、PGR、KCNN2、MYBPC1、HOXB13、COL1A1、GPX8、FAM13C、SLCO1B3、KLK2、TMEFF2、NROB1、PITX2、ACADL、SFRP4、AGR2、HNF1A、GRHL2或它们的任何组合;测量至少一种mRNA生物标记的表达水平;以及将至少一种mRNA生物标记的表达水平与至少一种mRNA生物标记的参考水平进行比较,其中至少一种mRNA生物标记的表达水平相比于参考水平提高指示高危前列腺癌。本发明所公开的方法允许基于全血样本的KLK3、PGR、KCNN2、MYBPC1、HOXB13、COL1A1、GPX8、FAM13C、SLCO1B3、KLK2、TMEFF2、NROB1、PITX2、ACADL、SFRP4、AGR2、HNF1A、GRHL2、或它们的任何组合的检测来预测高危前列腺癌。cDNA可通过从全血样本中分离RNA并从所分离的RNA合成cDNA而获自全血样本。用于分离RNA和合成cDNA的合适技术包括以上所公开的那些并且进一步公开于实施例部分中。在一些实施方案中,可在合成步骤之后预扩增cDNA。预扩增步骤可进行任何合适的循环数。循环数部分依赖于起始cDNA的量和/或进行扩增步骤所需的cDNA的量。合适的预扩增循环数包括但不限于1至20个循环。因此,预扩增步骤可进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个循环。在一些方面,预扩增步骤可进行2个循环。在其它方面,预扩增步骤可进行14个循环。在其它方面,预扩增步骤可进行多于20个循环。测量KLK3、PGR、KCNN2、MYBPC1、HOXB13、COL1A1、GPX8、FAM13C、SLCO1B3、KLK2、TMEFF2、NROB1、PITX2、ACADL、SFRP4、AGR2、HNF1A、GRHL2或它们的任何组合的表达水平包括:采用KLK3、PGR、KCNN2、MYBPC1、HOXB13、COL1A1、GPX8、FAM13C、SLCO1B3、KLK2、TMEFF2、NROB1、PITX2、ACADL、SFRP4、AGR2、HNF1A、GRHL2或它们的任何组合的引物对扩增cDNA,并且采用KLK3、PGR、KCNN2、MYBPC1、HOXB13、COL1A1、GPX8、FAM13C、SLCO1B3、KLK2、TMEFF2、NROB1、PITX2、ACADL、SFRP4、AGR2、HNF1A、GRHL2或它们的任何组合的探针对扩增的cDNA进行检测。测量步骤可在预扩增或未预扩增的cDNA上进行。可例如通过qRT-PCR进行cDNA扩增。合适的试剂和条件对本领域的技术人员是已知的。qRT-PCR可在多种合适的平台上进行。在一些方面,例如,qRT-PCR可使用FluidigmTM进行。因此,在一些实施方案中,测量步骤可包括在FluidigmTM平台上通过qRT-PCR用FluidigmTM基因表达芯片扩增cDNA,其中基因表达芯片包含如上讨论的KLK3、PGR、KCNN2、MYBPC1、HOXB13、COL1A1、GPX8、FAM13C、SLCO1B3、KLK2、TMEFF2、NROB1、PITX2、ACADL、SFRP4、AGR2、HNF1A、GRHL2或它们的组合的引物。在一些方面,基因芯片可包含每种待分析mRNA生物标记的一种引物对和一种探针。在其它方面,基因芯片可包含每种待分析mRNA生物标记的多于一种引物对和多于一种探针。可将全血样本采集到采血管中,包括但不限于PAX基因RNA管。辨别患有高危前列腺癌的患者的方法还可包括通过实时PCR确认至少一种mRNA生物标记的表达水平。在一些实施方案中,该方法可需要通过实时PCR测量多于一种mRNA生物标记的表达水平,并且检测大于具有阳性表达的标记物的阈值数。在这些实施方案中,具有大于具有阳性表达的标记物的阈值数的患者被视为生物标记阳性。生物标记阳性状态与高危疾病的可能性提高相关联。治疗患有前列腺癌的患者的方法本文公开了治疗患有前列腺癌的患者的方法,该方法包括:从患者的全血样本获得cDNA;使cDNA与基因芯片接触,其中基因芯片包含COL1A1的引物对和探针;测量COL1A1的表达水平;将COL1A1的表达水平与COL1A1的参考水平进行比较;以及如果COL1A1的表达水平相比于COL1A1的参考水平有所提高,则对患者进行治疗。在一些实施方案中,基因芯片还包含至少一种附加mRNA生物标记的引物对和探针,其中至少一种附加mRNA生物标记是KLK3、ACADL、GRHL2、HOXB13、HSD3B1、TMP.ERG、ARV3.7、ARV567、FOLH1、KLK2、HSD3B2、AGR2、AZGP1、STEAP2、KCNN2、GPX8、SLCO1B3、TMEFF2、SPINK1、SFRP4、NROB1、FAM13C、HNF1A、CDH12、PGR、PITX2、MYBPC1、FOXA1、SRD5A2、NPY、UGT2B17、CLUL1、C9orf152、FLNC、GPR39、RELN、THBS2、CYP17A1、CYP3A5、BRS3、SNAI2、CDH12、NKX3.1、LGR5、TRPM8、SLCO1B3、或它们的任何组合。在基因芯片包含至少一种附加mRNA生物标记的引物对和探针的实施方案中,该方法还包括:测量至少一种附加mRNA生物标记的表达水平;将至少一种附加mRNA生物标记的表达水平与至少一种附加mRNA生物标记的参考水平进行比较;以及如果至少一种附加mRNA生物标记的表达水平相比于至少一种附加mRNA生物标记的参考水平有所提高,则对患者进行治疗。在其它实施方案中,基因芯片还包含多种mRNA生物标记的引物对和探针。在一些方面,基因芯片可包含每种待分析mRNA生物标记的一种引物对和一种探针。在其它方面,基因芯片可包含每种待分析mRNA生物标记的多于一种引物对和多于一种探针。在基因芯片还包含至少一种附加mRNA生物标记的引物对和探针的实施方案中,治疗患有前列腺癌的患者的方法包括:测量COL1A1和至少一种附加mRNA生物标记的表达水平;将COL1A1和至少一种附加mRNA生物标记的表达水平与COL1A1和至少一种附加mRNA生物标记的参考水平进行比较;以及如果COL1A1和至少一种附加mRNA生物标记的表达水平相比于COL1A1和至少一种附加mRNA生物标记的参考水平有所提高,则对患者进行治疗。例如,并且不旨在进行限制,在一些实施方案中,该方法可包括:使cDNA与基因芯片接触,其中基因芯片包含COL1A1的引物对和探针以及MYBPC1的引物对和探针;测量COL1A1和MYBPC1的表达水平;将COL1A1和MYBPC1的表达水平与COL1A1和MYBPC1的参考水平进行比较;以及如果COL1A1和MYBPC1的表达水平相比于COL1A1和MYBPC1的参考水平有所提高,则对患者进行治疗。在基因芯片还包含多种mRNA生物标记的引物和探针的实施方案中,治疗患有前列腺癌的患者的方法包括:测量于多种mRNA生物标记的表达水平;将mRNA生物标记的表达水平与每种mRNA生物标记的参考表达水平进行比较;以及如果检测出大于表达水平高于参考水平的mRNA生物标记的阈值数,则对患者进行治疗。cDNA可通过从全血样本中分离RNA并从所分离的RNA合成cDNA而获自全血样本。用于分离RNA和合成cDNA的合适技术包括以上所公开的那些并且进一步公开于实施例部分中。在一些实施方案中,可在合成步骤之后预扩增cDNA。预扩增步骤可进行任何合适的循环数。循环数部分依赖于起始cDNA的量和/或进行扩增步骤所需的cDNA的量。合适的预扩增循环数包括但不限于1至20个循环。因此,预扩增步骤可进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个循环。在一些方面,预扩增步骤可进行2个循环。在其它方面,预扩增步骤可进行14个循环。在其它方面,预扩增步骤可进行多于20个循环。测量单独的或与至少一种附加mRNA生物标记结合的COL1A1的表达水平包括:采用单独的或与至少一种附加mRNA生物标记的引物对结合的COL1A1的引物对来扩增cDNA,并且采用单独的或与至少一种附加mRNA生物标记的探针结合的COL1A1的探针对扩增的cDNA进行检测。测量步骤可在预扩增或未预扩增的cDNA上进行。可例如通过qRT-PCR进行cDNA扩增。合适的试剂和条件对本领域的技术人员是已知的。qRT-PCR可在多种合适的平台上进行。在一些方面,例如,qRT-PCR可使用FluidigmTM进行。因此,在一些实施方案中,测量步骤可包括在FluidigmTM平台上通过qRT-PCR用FluidigmTM基因表达芯片扩增cDNA,其中基因表达芯片包含如上讨论的单独的或与至少一种附加mRNA生物标记的引物结合的COL1A1的引物。可将全血样本采集到采血管中,包括但不限于PAX基因RNA管。治疗患有前列腺癌的患者的方法还可包括通过实时PCR确认至少一种mRNA生物标记的表达水平。用于治疗COL1A1或COL1A1和至少一种附加mRNA生物标记的表达水平提高的患者的合适化合物包括但不限于:基因芯片本文公开了用于检测患者的全血样本中的前列腺癌特异性mRNA转录物的基因芯片。在一些实施方案中,基因芯片可包含引物对和探针,所述引物对和探针被构造成能够扩增和检测以下项:KLK3、ACADL、GRHL2、HOXB13、HSD3B1、TMP.ERG、ARV3.7、ARV567、FOLH1、KLK2、HSD3B2、AGR2、AZGP1、STEAP2、KCNN2、GPX8、SLCO1B3、TMEFF2、SPINK1、SFRP4、NROB1、FAM13C、HNF1A、CDH12、PGR、PITX2、MYBPC1、FOXA1、SRD5A2、COL1A1、NPY、UGT2B17、CLUL1、C9orf152、FLNC、GPR39、RELN、THBS2、CYP17A1、CYP3A5、BRS3、SNAI2、CDH12、NKX3.1、LGR5、TRPM8、SLCO1B3、或它们的任何组合。在一些实施方案中,基因芯片可包含多种引物对和多种探针,所述多种引物对和多种探针被构造成能够扩增和检测以下项:KLK3、ACADL、GRHL2、HOXB13、HSD3B1、TMP.ERG、ARV3.7、ARV567、FOLH1、KLK2、HSD3B2、AGR2、AZGP1、STEAP2、KCNN2、GPX8、SLCO1B3、TMEFF2、SPINK1、SFRP4、NROB1、FAM13C、HNF1A、CDH12、PGR、PITX2、MYBPC1、FOXA1、SRD5A2、COL1A1、NPY、UGT2B17、CLUL1、C9orf152、FLNC、GPR39、RELN、THBS2、CYP17A1、CYP3A5、BRS3、SNAI2、CDH12、NKX3.1、LGR5、TRPM8、SLCO1B3、或它们的任何组合。例如,并且不旨在被限制,在一些方面,基因芯片可包含每种待分析mRNA生物标记的一种引物对和一种探针。在其它方面,基因芯片可包含每种待分析mRNA生物标记的多于一种引物对和多于一种探针。合适的探针包括但不限于表2所列的那些。表2—用于所公开的基因芯片的示例性探针测定ID(LifeTechnologies)靶标Hs02576345_m1KLK3Hs00380670_m1GPX8Hs00165843_m1SRD5A2Hs01085277_m1ACADLHs00227745_m1GRHL2H00426435_m1HSD3B1Hs00197189_m1HOXB13Hs00428383_m1KLK2Hs03043658_m1NROB1Hs00167041_m1HNF1AHs01591157_m1AZGP1P1Hs00189528_m1FOLH1(PSMA)Hs04234069_mHPTX2(PITX2)Hs00300346_m1FAM13CHs00164004_m1COL1A1Hs01556702_m1PGRHs00362037_m1N-钙粘蛋白(CDH12)Hs00605123_m1HSD3B2Hs01030641_m1KCNN2Hs00401292_m1STEAP2Hs00180066_m1SFRP4Hs00356521_m1AGR2Hs00162154_m1SPINK1Hs00270129_m1FOXA1Hs00251986_m1SLCO1B3Hs01086906_m1TMEFF2Hs00159451_m1MYBPC1Hs00179951_m1(铃蟾肽)BRS3Hs00900370_m1CHGAHs00969422_m1LGR5Hs00950344_m1SNAI2报告基因=FAMTMP:ERG和ARV7(ARV3.7)的合适引物和探针包括但不限于表3所列的那些。表3—用于所公开的基因芯片的示例性引物和探针所有测定均使用FAMTaqMan报告基因。对照基因测定使用内源性对照。实施例方法血液RNA人工提取规程如PAXgeneBloodRNA试剂盒手册(PreAnalytiXGmbH;March2009)中所述,使用QIAGEN’sBloodRNA试剂盒提取RNA,下面进行简要描述。将BloodRNA管用甩出式转子以3000-5000×g离心10min。通过滗析或吸移移除上清液。将4ml不含RNA酶的水添加到沉淀中,并将管用新的次级BDHemogard闭合件封闭。对管进行涡旋直至沉淀可视地溶解,并且以3000-5000×g离心10min。移除整个上清液并丢弃。添加350μl的缓冲液BR1并进行涡旋直至沉淀可视地溶解。将样本吸移到1.5ml微量离心管中。添加300μl缓冲液BR2和40μl蛋白酶K。通过涡旋将样本混合5秒,并且使用振荡培养箱以400-1400rpm在55℃下温育10分钟。将溶胞产物直接吸移到置于2ml处理管中的Shredder离心柱(淡紫色)中,并以最大速度(但不超过20,000×g)离心3分钟。将流出级分的整个上清液小心地转移到新的1.5ml微量离心管中而不扰动处理管中的沉淀。添加350μl乙醇(96-100%),通过涡旋进行混合,并且短暂地离心以移除管封盖内侧的小滴。将700μl样本吸移到置于2ml处理管中的RNA离心柱(红色)中,并且以8000-20,000×g离心1min。将离心柱置于一个新的2ml处理管中。将剩余的样本吸移到RNA离心柱中,并且以8000-20,000×g离心1min。将离心柱置于一个新的2ml处理管中,并且丢弃包含流出部分的旧处理管。将350μl的缓冲液BR3吸移到RNA离心柱中,并且以8000-20,000×g离心1min。将离心柱置于一个新的2ml处理管中,并且丢弃包含流出部分的旧处理管。将10μlDNaseI原液添加到1.5ml微量离心管中的70μl缓冲液RDD,并且轻轻地混合。将DNaseI温育混合物(80μl)直接吸移到RNA离心柱膜上,并置于工作台顶部(20-30℃)上15min。将350μl的缓冲液BR3吸移到RNA离心柱中,并且以8,000-20,000×g离心1min。将离心柱置于一个新的2ml处理管中,并且丢弃包含流出部分的旧处理管。将另外500μl的缓冲液BR4添加到PAXgeneRNA离心柱中并以8000-20,000×g离心3分钟。丢弃包含流出部分的管并将RNA离心柱置于一个新的2ml处理管中,并且以8000-20,000×g离心1分钟。丢弃包含流出部分的管。将RNA离心柱置入1.5ml微量离心管中,并且将40μl的缓冲液BR5直接吸移到RNA离心柱膜上。将柱以8000-20,000×g离心1分钟,以洗脱出RNA。使用40μl的缓冲液BR5和相同的微量离心管重复该步骤。将洗脱液在振荡培养箱中于65℃温育5min而不摇动。在温育之后,将管直接在冰上冷却。如果不立即使用RNA样本,则将其储存于-20℃或-70℃下。cDNA合成2×逆转录主混合物的制备:如表4所示,对于适当的反应数(#反应+10%,每20-μL反应),在冰上制备主混合物(2×)。备注:将10μL的样本RNA添加到主混合物中以具有20μL的最终反应体积。表4将主混合物涡旋若干次(5至10次)以进行混合,然后短暂地离心(1500×g,5至10秒)。将10μl的反应混合物加入到96孔板的各个适当孔中。将RNA样本添加到主混合物将10μL的各个RNA样本添加到96孔板的适当孔中(包括水阴性对照),以具有20μL的最终反应体积。通过上下吸移3次轻轻地混合溶液。将96孔反应板用板密封件密封并短暂离心(1500×g,60秒)。ABI9700设定:ABI9700如下设定:步骤1:25℃10min步骤2:37℃120min步骤3:85℃5秒步骤4:4℃无限保持将反应体积设定为20μL。cDNA预扩增用于预扩增和实时PCR的引物探针测定混合物的制备:制备100μl的20×引物-探针混合物用于实时PCR。0.2×预扩增测定池的制备:如表5所示制备0.2×预扩增测定池。备注:以下体积用于制备400μl0.2×预扩增测定池。可根据被测试的样本数量/Taqman测定相应地调整体积。表5样本和2×主混合物制备:将合成cDNA反应板和0.2×测定混合池置于冰上。如表6所示制备2×预扩增主混合物。表6组分一次反应的体积(μL)2×TaqMan预扩增主混合物7.50.2×测定池13.75总体积11.25将11.25μL的主混合物等分到96孔反应板的适当孔中。将3.75μL的各个cDNA样本(包括阳性和阴性对照)转移到主混合物反应板的适当孔中,通过上下吸移3次进行混合,并且短暂地离心。ABI9700设定:ABI9700如下设定:步骤1:95℃10min步骤2:95℃15秒步骤3:60℃4min步骤4:设定步骤2-3持续14个循环步骤5:4℃无限保持将反应体积设定为15μL。预扩增产物稀释:在预扩增完成之后,将预扩增反应板短暂地离心(在1500×g下60秒)。将135μl的IDTE添加到各个反应孔(1:10稀释)中,通过上下吸移3次进行均匀混合,并且短暂地离心(1500×g下5至10秒)。将预扩增产物于-20℃下储存直至进一步使用。FluidigmTM96.96实时PCR制备10×分析用试样:使用表7中的体积制备10×分析用试样的等分试样。可将体积适当放大以用于多个运行。表7制备样本预混物和样本:将表8中的组分混合以制备样本预混物和最终样本混合物。可将体积适当放大以用于多个运行。表8将TaqMan基因分型混合物与GE样本加载试剂在1.5mL管中混合——体积足以填充整个芯片。就各个样本而言,然后可将3.3μL的该样本预混物等分。负载芯片:在完成Prime(136x)脚本后,将初始化芯片从IFCControllerHX中移除。将5μL的各个分析用试样和各个样本吸移到其芯片上的对应通道中。将芯片放回IFCControllerHX中。使用IFCControllerHX软件,运行LoadMix(136x)脚本,以将样本和分析用试样装载到芯片中。当LoadMix(136x)脚本完成时,将装载的芯片从IFC控制器中移除。使用数据采集软件:将芯片装载到BioMark中,并且遵循基因表达测定的说明书/运行96.96特定规程。分析:选择自动检测器进行数据分析。CT<35并且存在于甚至4次平行测定之一——认为就扩增而言样本呈阳性。ARAxis-液体活组织检查测定开发-方法引物验证:定制设计和再次验证的Taqman基因表达测定从ABI订购(标记物和对应基因ID的详细列表提供于表2和3中)。使用示出表达大部分这些基因的4种前列腺癌细胞系(VCaP、LNCaP、22RV1和PC-3)的组进行测定和引物验证。对FFPET(福尔马林固定的石蜡包埋的组织)来源的RNA验证为了测试这些标记物是否表示真实的侵略性肿瘤,将测定在一组40个FFPE前列腺癌和邻近的正常组织来源的RNA样本上进行测试。使用Qiagen’sAllPrepDNA/RNAFFPET试剂盒提取FFPET块的RNA。在Agilent生物分析仪上检查RNA浓度。采用Qiagen’sQuantitectTM逆转录试剂盒和规程,对12μl体积的350-500ng总RNA进行逆转录。使用TaqManPreAmp主混合物/规程,在25μl反应体积中对具有48种标记物的约1/3cDNA预扩增14个循环。预扩增的cDNA用1×TE缓冲液以1:20比率稀释。将稀释的预扩增产物装载到96.96基因表达芯片上并遵循用户指南在Biomark上运行。ACTB和GAPDH用作内源性对照。对样本一式四份进行测试(以上所述——使用QiagenDNA-RNAFFPET试剂盒提取RNA)。血液中掺加的细胞系:为了测试标记物是否在全血细胞(WBC)的背景中差异性表达,将VCaP细胞系以系列稀释度掺加(10、50、100和500细胞)到正常供体的(Quiagen,Valencia,CA)血样中。使用Qiagen’s血液RNA规程(以上所述)提取总RNA。在Agilent生物分析仪系统上测量RNA浓度。使用AppliedBiosystemsHighCapacitycDNA逆转录试剂盒/规程,使用10μl的RNA进行cDNA制备。利用TaqManPreAmp主混合物/规程(AppliedBiosystems),在15μl反应体积中对具有48种基因标记物的约1/3cDNA预扩增14个循环。预扩增的cDNA用1×TE缓冲液进一步稀释至1:10比率。遵循Fluidigm’sBioMark用户指南,将稀释的预扩增产物装载到96.96基因表达芯片上并在Biomark上运行。一式两份测试各个样本和标记物,因此对于每个基因/样本产生4个值。将ACTB、GAPDH和RPL19用作内源性对照并将BST1和PTPRC用作WBC对照。来自前列腺癌患者的Testing来源的RNA:在来源于143名前列腺癌患者和20名正常男性受检者(癌样本得自CapitalBiosciences,Cureline,andConversantBio)的RNA样本中测试约170个标记物。筛选从侵略性与无痛性或正常供体特异性差异性检出的标记物。ViiA7TM器械上进行RT-PCR测定以确认生物标记结果:在ViiA7TM(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)上进一步测试示出在BiomarkTM(Fluidigm,SanFranciso,CA)平台上所检出的标记物,以验证/确认结果。所有随后在ViiA7上验证的标记物将被筛选出来,以制备液体活组织检查组。BioMarkTMHD系统:该高通量实时PCR测定使用BioMarkTMHD系统进行,其允许在96个样本中同时检测96种分析物,从而从单次运行产生9,216个数据点。BioMarkTMHD平台利用样本的微流体分布以及仅需要7nL反应物的测定并且花费小于3小时来完成。方法:使用AppliedBiosystemsHighCapacitycDNA逆转录试剂盒,随后用AppliedBiosystemsTaqmanPre-Amp主混合物预扩增cDNA10/14个循环,对得自FFPET的RNA以及RNA样本进行逆转录。稀释扩增的cDNA并在AppliedBiosystems’sViiA7TM或BiomarkTM平台上测试以进行基因表达。从前列腺癌患者的全血中特异性检出的mRNA标记物的检测由从前列腺癌患者和健康对照采集的全血的mRNA标记物表达水平组成的数据用于导出测定参数。为了允许独立验证测定,将数据以70%:30%比率分成训练和验证组。阈值Ct值基于训练数据中的受试者工作特征(ROC)分析得到,并且测定的诊断特征使用敏感性、特异性和ROC曲线下方的面积(AUC)来评价。使用获自训练数据的阈值根据验证数据独立地评价测定,以预测哪个患者具有前列腺癌,并且评价测定的敏感性和特异性。对各个标记物测定的阈值Ct值列出于表9中。代表性标记物的各个ROC曲线示出于图1中。表9——所选标记物组的诊断信息标记物用基因符号表示。切分点指示对各个标记检测的阈值Ct值。敏感性(Sens)等同于这样的概率:标记物将在患有前列腺癌的患者中检出。特异性等同于这样的概率:标记物将在未患有前列腺癌的患者中检测不到。ROC曲线下的面积(AUC)的概率在于,相对于健康对照,标记物将以更高水平在前列腺癌患者中表达。基于检测全血的mRNA标记物预测高危前列腺癌在由从前列腺癌患者和健康对照采集的全血的mRNA标记物的表达水平组成的数据集中,对所选标记物的预后能力进行评价。利用上述ROC分析得到阈值,以在训练数据中区分开前列腺癌和正常健康对照。利用Fisher精确检验法评价与临床危险因子的关联。与临床危险因子显著相关的所选标记物列出于表10-12中。表10——存在/不存在mRNA标记物与Gleason评分值的关联标记物表达NGLEASON.低GLEASON.高p值HOXB13不存在38317-存在2612140.0060PGR不存在361917-存在282440.0072使用前列腺肿瘤与正常健康对照的最佳检测得到的阈值对标记物表达进行二分。用诊断的Gleason评分值,将患者二分成低(Gleason<=6)和高(Gleason>=8)危子集。该表显示出表达/不表达各个标记物的肿瘤总数(N),并且将标记物检测汇总在Gleason低危组和Gleason高危组中。显著关联由Fisher精确检验法(p值)确定。表11——存在/不存在mRNA标记物与诊断时测量的PSA水平的关联转录物表达NPSA.低PSA.高p值KLK3不存在544410-存在9450.0287PGR不存在352312-存在282530.0385使用前列腺肿瘤与正常健康对照的最佳检测得到的阈值对标记物表达进行二分。将患者二分成低(PSA<20ng/mL)和高(PSA>=20ng/mL)危子集。该表显示出表达/不表达各个标记物的肿瘤总数(N),并且将标记物检测汇总在PSA低危组和PSA高危组中。显著关联由Fisher精确检验法(p值)确定。表12——存在/不存在mRNA标记物与癌细胞转移的关联转录物表达NLOCALMETp值PGR不存在36531-存在2813150.0055KCNN2不存在22220-存在4216260.0187MYBPC1不存在15114-存在4917320.0482使用前列腺肿瘤与正常健康对照的最佳检测得到的阈值对标记物表达进行二分。该表显示出表达/不表达各个标记物的肿瘤总数(N),并且将标记物检测汇总在有/没有转移性复发的肿瘤中。显著关联由Fisher精确检验法(p值)确定。指示高危前列腺癌的多元生物标记组的辨别在由从前列腺癌患者和健康对照采集的全血的mRNA标记物的表达水平组成的数据集中,鉴定包括多元mRNA生物标记的生物标记组。十六种基因(ACADL、AGR2、COL1A1、FAM13C、GPX8、GRHL2、HNF1A、HOXB13、KLK2、KLK3、MYBPC1、NR0B1、PITX2、SFRP4、SLCO1B3、TMEFF2)被鉴定出在前列腺癌样本中的表达相对于健康志愿者显著更高。将这16种基因组合成多元生物标记组(如下所述)。使用ROC分析得到阈值(如下所述)。阈值被选择用于辨别具有90%特异性的前列腺癌患者,即90%或更多个健康志愿者将被正确辨别为健康志愿者。机器学习过程用于定义患者应当被视为高危的所检测阳性生物标记数目。为了防止过度拟合,将数据如上所述分成训练和验证组。训练组用于定义分类规则,包括最佳的阳性标记物数目。具体地,通过从训练数据随机选择100个样本来产生自助样本(bootstrapsamples)。通过评价所预测的生物标记状态与生化复发时间的相关性,创建分类规则。使用一致性指数测量相关性,其测量生物标记阳性状态的受检者将在生物标记阴性状态的受检者之前经历生化复发的概率。八种标记被辨别为分类规则的最佳特征数,即大于8个标记物呈阳性的患者将被视为生物标记阳性,并且将预测生化复发的时间更短。分类规则与生化复发时间之间的关联使用Cox回归分析采用独立的样本验证组加以验证。多元生物标记组辨别出生化复发时间相比于生物标记阴性群体显著更短的受检者的子集(HR=7.94,p-值=0.024)。本领域内的技术人员将会知道可对本发明的优选实施方案作出许多改变和修改,而且此类改变和修改不脱离本发明精神的情况下进行。因此,所附权利要求旨在覆盖落入本发明的真实精神和范围内的所有此类等同变化。本文档所引用或描述的每项专利、专利申请和专利公开的公开内容均以引用方式全文并入本文。...
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