同时检测大鼠五种病原体的引物组、试剂盒及多重免疫荧光分析方法与流程

文档序号:12413208阅读:来源:国知局

技术特征:

1.同时检测大鼠RTV、TMEV、RCV、PVM、M. pulmonis五种病原体的引物组,包括6对引物,所述6对引物是通过对6对原始引物进行修饰而成;所述修饰为每对原始引物中的一条原始引物的5’端与对应的tag序列的3’端通过间臂连接,另一条原始引物的5’端添加生物素标记;

所述的原始引物对如下:

RTV原始上游引物:5’-GGAAACTTAGAGCAGACATCG-3’,

RTV原始下游引物:5’-TCCACAGAGAACAACCATCG-3’,

TMEV原始上游引物:5’-CGTTGGAAAAGCACCTCTCAC-3’,

TMEV原始下游引物:5’-TCGGAGTCGGTTGACTTAGAT-3’,

RCV原始上游引物:5’-TGGMATCCTCAAGAAGACCACTT-3’,

RCV原始下游引物:5’-ATGCCMGAAAACCARGAGTAATG-3’,

PVM原始上游引物:5’-GCTGGCATTCCACATAACC-3’,

PVM原始下游引物:5’-CCCACAAGGTACACGGAGA-3’,

M. pulmonis原始上游引物:5’-GGAAATGCCCTAAGTATGACGG-3’,

M. pulmonis原始下游引物:5’-CGGATAACGCTTGCACCCTA-3’,

内标MS2原始上游引物:5’-CGCAGAATCGCAAATACAC-3’,

内标MS2原始下游引物:5’-TAACAATAAGCTCGCAGTCG-3’;

所述的tag序列如下:

RTV的tag序列为:5’-ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-3’,

TMEV的tag序列为:5’-TTAAACAATCTACTATTCAATCAC-3’,

RCV的tag序列为:5’-CACTTAATTCATTCTAAATCTATC-3’,

PVM的tag序列为:5’-ATACTTTACAAACAAATAACACAC-3’,

M. pulmonis的tag序列为:5’-TACTACTTCTATAACTCACTTAAA-3’,

内标MS2的tag序列为:5’-ATTAAACAACTCTTAACTACACAA-3’。

2.根据权利要求1所述的引物组,其特征在于:所述间臂为12~18个原子的引物中间修饰物。

3.根据权利要求2所述的引物组,其特征在于:所述间臂为六乙二醇间臂。

4.同时检测大鼠RTV、TMEV、RCV、PVM、M. pulmonis五种病原体的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒含有权利要求1所述的引物组、6种编码不同荧光色的荧光编码微球,所述的独立荧光编码微球含有与权利要求1引物中tag序列互补配对的anti-tag序列。

5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于:还含有链霉亲和素-藻红蛋白复合物、RT-PCR 扩增试剂、内标MS2标准品、混合阳性对照、阴性对照,所述混合阳性对照为同时含有RTV、TMEV、RCV、PVM、M. pulmonis五种病原体的核酸样品;所述阴性对照为不含有RTV、TMEV、RCV、PVM、M. pulmonis五种病原体的核酸样品。

6.同时检测大鼠RTV、TMEV、RCV、PVM、M. pulmonis五种病原体的多重免疫荧光分析方法,包括如下步骤:

1)从样品中提取病原体RNA或DNA,作为模板,同时设置空白对照、阴性对照、混合阳性对照;所述空白对照为不添加模板;所述阴性对照为以不含有RTV、TMEV、RCV、PVM、M. pulmonis五种病原体的核酸样品为模板;所述混合阳性对照为以同时含有RTV、TMEV、RCV、PVM、M. pulmonis五种病原体的核酸样品为模板;

2)在样品中加入内标MS2的核酸作为质控,用权利要求4所述试剂盒内的引物组进行RT-PCR扩增;

3)将扩增产物、权利要求4所述试剂盒内的6种编码不同荧光色的荧光编码微球、链霉亲和素-藻红蛋白进行杂交;

4)杂交结束后,通过Luminex系统对杂交产物进行检测分析,读取不同病原体的MFI值;

5)结果判断:当样本的MFI值/空白对照的MFI值≥3.0时,判为阳性,否则判为阴性;

上述方法用于非疾病的诊断和治疗。

7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:步骤2)中,RT-PCR扩增的20µL反应体系含有:5×buffer4µL、dNTP0.8µL、Enzyme mix0.8µL、引物组内每对引物混合液(10µM)各0.4µL、模板 4µL、无RNase水8µL。

8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:步骤2)中,RT-PCR扩增的反应程序为:48~52℃反转录25~35min;95℃预变性15min;94℃变性30s,60℃退火90s,72℃延伸30s;循环35次;72℃终延伸10min。

9.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:步骤3)中,杂交的100µL反应体系含有:6种编码不同荧光色的荧光编码微球20µL、链霉亲和素-藻红蛋白75µL、扩增产物 5µL。

10.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:步骤3)中,杂交的反应程序为:43~47℃反应20~30min。

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