一种新型的分离败血症中革兰氏阳性病原菌的方法革兰氏阳性病原菌与流程

本发明涉及生物技术领域，具体是涉及基于磁性纳米粒子的革兰氏阳性病原菌分离方法。

背景技术：

败血症是严重的全身性感染疾病,病情复杂多变,病死率高。败血症患者血液中的病原菌主要包括革兰氏阳性病原菌和革兰氏阴病原菌。在治疗过程中，革兰氏阳性病原菌和革兰氏阴性菌细胞壁结构差别较大,选用药物也有一定差别。传统的鉴别败血症患者血液中病原菌种类的方法主要是血平板培养法，但该方法周期长，大概需要5-7天，在这一过程中很可能会使病人的病情进一步加重。另外，如若不对血液中病原菌进行分类，就只能使用广谱的抗菌素。近年来，随着人类广谱和超广谱抗生素的大量生产和应用，导致多重耐药菌、条件病原菌引起的各类感染增加，抗生素的选择范围缩小。目前全球细菌耐药形势空前严峻，细菌耐药已被列为威胁人类健康的三大难题之一。同时，广谱和超广谱抗菌素还会对肠道中的益生菌产生抑制作用，从而对健康产生一定的危害。因此，为了提高对败血症患者的治疗效果,在治疗前对患者血液中的病原菌种类进行鉴别，能够指导临床更加科学合理使用抗菌药物。因此，建立一种高效、快速检测革兰氏阳性病原菌的新方法显得尤为迫切。鉴于需要建立一种高效，快速的检测方法，基于功能化的磁性纳米粒子的分离技术在病原菌监测中得到了迅速发展。

磁分离技术是病原菌快速筛查技术的重要组成部分之一，该技术可高效捕获、浓缩增菌液中目标菌、提高病原菌检测的灵敏度，缩短检测时间。近年来，基于万古霉素修饰的磁性纳米粒子分离法将万古霉素连接到磁性纳米粒子上，然后将万古霉素修饰的磁性纳米粒子投入样品液中对目标菌进行捕获、富集，分离。然而，目前该基于万古霉素偶联磁性纳米粒子磁分离技术存在诸多局限性：1)万古霉素是小分子，万古霉素直接修饰在磁性纳米粒子表面不利于其与细菌表面的d-丙氨酰-d-丙氨酸(d-ala-d-ala)分子的结合；从而降低了捕获效率；2)万古霉素直接偶联于磁性纳米粒子表面的方式，往往是将万古霉素直接偶联于磁性纳米粒子上，此过程常常会导致万古霉素的活性大大地降低并且导致万古霉素的空间方向发生改变增大了万古霉素分子的空间位阻效应，从而降低了万古霉素的捕获效率3)免疫分离方法中所用到的抗体特异性好，但价格昂贵，不易获得和保存；4)磁性纳米粒子偶联万古霉素时，一般采用疏水吸附或化学偶联方式将具有活性的万古霉素偶联在活化的磁性纳米粒子表面。万古霉素与磁性纳米粒子表面距离太近，导致万古霉素生物活性下降，降低磁捕获效率。

临床上应用的传统鉴别革兰氏阳性病原菌和革兰氏阴性病原菌的方法，主要是血平板培养法。该方法不但周期长，而且耗费大量的人力物力。

技术实现要素：

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种低梯度磁场下，简便、快捷，高效的磁富集分离患者血液中的革兰氏阳性病原菌的方法。

革兰氏阳性病原菌的快速分离方法，包括以下步骤：(1)取2ml的磁性纳米粒子，加入到8mlph＝7.4的无菌的pbs溶液中，然后在外加磁场的作用下，对磁性纳米粒子进行洗涤，重复3次，将洗涤好的磁性纳米粒子重悬于10ml无菌的pbs溶液中；(2)5.8mgedc，溶于290μl无菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl无菌的pbs中，然后将溶解后的edc和nhss加入到洗涤过的磁性纳米粒子溶液中，活化1h；(3)将活化后磁性纳米粒子用无菌的pbs洗涤3次，重悬于8ml无菌的pbs溶液中；(4)称取聚乙二醇90mg，溶解于1.8ml无菌的pbs溶液中，然后加入到活化后的磁性纳米粒子溶液中，反应3h，然后无菌的pbs洗涤3次，重悬于8ml无菌的pbs溶液中，得到聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子；(5)称取91.3mg万古霉素，48.3mgedc和54.8mgnhss,分别溶于无菌的pbs溶液中，然后混合通过碳化二亚胺法，活化万古霉素表面羧基，活化10min；(6)将活化后的万古霉素加入到聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子中，孵育6h；(7)反应完毕后，用无菌的pbs洗涤3次，重悬于10ml无菌的pbs溶液中，得到浓度为2mg/ml的万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物，用于富集革兰氏阳性病原菌。(8)取10ml待测样品溶液，加入1mg万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物，置于培养箱上，以200rpm的转速37℃孵育45min；插入磁力架分离6min；(9)磁分离后，无菌pbs溶液清洗后，用无菌的pbs缓冲液重悬即得富集有革兰氏阳性病原菌-万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物。

所述两端氨基的聚乙二醇，其分子量为2000da。结构如图1。

所述纳米磁性纳米粒子粒径为180nm，表面羧基。

万古霉素通过羧基与聚乙二醇的氨基相连，然后聚乙二醇的另一端氨基与磁性纳米粒子表面的羧基相连，万古霉素通过五个氢键与革兰氏阳性病原菌表面的d-丙氨酰-d-丙氨酸(d-ala-d-ala)分子相连。

具体原理见图2。

本方法适用于富集分离复杂复杂基质中分离革兰氏阳性病原菌，如裂解血，血清，以及全血样品。

采用本发明技术方案具有如下有益效果：

1、本发明采用的是180nm的磁性纳米粒子，主要用于血液中目标菌的快速富集，而采用30nm或者50nm纳米磁珠结合树状分子的富集方法是用于磁信号的放大。

2、本发明采用的万古霉素是传统的商业药物，相比于抗体，具有稳定好，成本低，质量可控等优点。基于上述优点，在单次分离过程中，本发明构建的分离万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物在成本上比免疫磁分离陈本降低了195倍；在材料保存方面比免疫磁珠保质期也更长。

3、在败血症患者血液中，是多种致病菌共存的环境。本发明采用的万古霉素是光谱的识别革兰氏阳性菌的分子识别剂，用于分离基质中的革兰氏阳性菌是一种通用的分离策略，可以将基质中的大多数革兰氏阳性菌都分离出来，然后通过聚合酶链式反应(pcr)或者选择性培养进行鉴别。相比之下，抗体因其只能专一的识别，从而分离出对应的目标菌，其他存在于血液中的致病菌无法鉴别。

4、本发明合成的万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物是先将聚乙二醇偶联到磁性纳米粒子的表面，然后再将万古霉素修饰到聚乙二醇-磁性纳米粒子表面，相比于万古霉素先与聚乙二醇偶联后，再与结合多聚赖氨酸(pll)修饰磁性纳米粒子的方法，本发明的万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物不仅可以达更好的分离效率，而且在材料合成中耗时更短时间和成本更低。

5、本发明将聚乙二醇分子先偶联在磁性纳米粒子表面，然后再将万古霉素分子偶联于聚乙二醇包被的磁性纳米粒子上，避免了常规方法中将万古霉素分子偶联于磁珠表面或者直接将万古霉素分子直接接在磁性纳米粒子表面，导致万古霉素或者万古霉素分子活性降低和空间位阻大的缺点。同时聚乙二醇作为分子臂具有很好的灵活性，有利于万古霉素分子与单增李斯特菌表面的d-丙氨酰-d-丙氨酸(d-ala-d-ala)分子相连，提高了捕获效率。相比于直接偶联或者借助万古霉素分子中氨基作为反应基团的方法，该方法分离单增李斯特菌能力更强，特别适用于复杂样品单增李斯特的分离，如食品样品、全血样品等。

6、磁性纳米粒子偶联万古霉素时，一般采用疏水吸附或化学偶联方式将具有活性的万古霉素联接在磁性纳米粒子表面。万古霉素与磁性纳米粒子表面距离太近，磁性纳米粒子本身性质及其表面残留的疏水或强亲水基团容易引起万古霉素空间构象发生改变，导致万古霉素生物活性下降。然而本实验方案在偶联过程中引入聚乙二醇分子，其具有一定的空间长度，从而使万古霉素分子远离磁性纳米粒子和磁性纳米粒子表面，避免了磁性纳米粒子本身性质及表面对万古霉素分子的影响。同时，引入聚乙二醇却不会影响万古霉素分子的空间构象，从而起到了保护万古霉素分子生物活性的作用。

7、本发明采用聚乙二醇分子，提高磁性纳米粒子在溶液的稳定性，避免发生沉淀，增加复合物的水溶性和生物相容性。

附图说明

图1两端修饰有氨基的聚乙二醇的结构示意图；

图2本发明所涉及的磁分离技术的操作流程图；

具体实施方式

为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

磁性纳米粒子(180nm)购买于上海奥润有限公司。

两端氨基的聚乙二醇2000da，购自于威海晨源化工新材料有限公司。

万古霉素分子购自于上海阿拉丁有限公司。

n-羟基丁二酰亚胺nhss,乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐edc等均为常规试剂，不再赘述。

0.01mpbs配制方法：8.0gnacl、0.2gkcl、0.24gkh2po4、1.44gna2hpo4溶解于800ml蒸馏水中，用5mnaoh调整ph至7.4，再定容至1000ml即得0.01mpbs。

实施例1

1.万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物合成，按照如下步骤制备:

(1)取2ml的磁性纳米粒子，加入到8mlph＝7.4的无菌的pbs溶液中，然后在外加磁场的作用下，对磁性纳米粒子进行洗涤，重复3次，将洗涤好的磁性纳米粒子重悬于10ml无菌的pbs溶液中；

(2)5.8mgedc，溶于290μl无菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl无菌的pbs中，然后将溶解后的edc和nhss加入到洗涤过的磁性纳米粒子溶液中，活化1h；

(3)将活化后磁性纳米粒子用无菌的pbs洗涤3次，重悬于8ml无菌的pbs溶液中；

(4)称取聚乙二醇90mg，溶解于1.8ml无菌的pbs溶液中，然后加入到活化后的磁性纳米粒子溶液中，反应3h，然后无菌的pbs洗涤3次，重悬于8ml无菌的pbs溶液中，得到聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子；

(5)称取91.3mg万古霉素，48.3mgedc和54.8mgnhss,分别溶于无菌的pbs溶液中，然后混合通过碳化二亚胺法，活化万古霉素表面羧基，活化10min；

(6)将活化后的万古霉素加入到聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子中，孵育6h；

(7)反应完毕后，用无菌的pbs洗涤3次，重悬于10ml无菌的pbs溶液中，得到浓度为2mg/ml的万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物，用于富集革兰氏阳性病原菌。

2.富集捕获：取待测样品溶液10ml，加入1mg万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物，置于混匀仪上，以200rpm的转速室温孵育45min形成革兰氏阳性病原菌-万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物；将离心管插入常规磁力架分离6min；

3.去离子水轻轻清洗后，用pbs缓冲液重悬即得革兰氏阳性病原菌-万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物。

实施例2富集效果实验

(1)取1ml浓度为10⁵cfu/ml的革兰氏阳性病原菌于1.5ml无菌离心管中，12000rpm离心5min，弃上清，用等体积无菌pbs溶液重悬。

(2)富集捕获：分别设置本发明技术方案组：聚乙二醇-磁性纳米粒子组、万古霉素-磁性纳米粒子、万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子组富集目的菌。

(3)磁分离后，将上清液转入无菌离心管中，而分离得到的革兰氏阳性病原菌的万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子则用pbs清洗两次，混合均匀，并用1ml无菌pbs溶液重悬革兰氏阳性病原菌-万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物。

(4)捕获率计算：将各组富集的革兰氏阳性病原菌重悬液进行梯度稀释后，用平板对每个梯度计数，通过捕获效率公式计算革兰氏阳性病原菌的捕获效率，每次实验重复三次。各组捕获效率的计算公式如下：[被富集吸附的菌落总数/(上清液中菌落总数+被富集吸附的菌落总数)]×100％。

所述各组富集捕获革兰氏阳性病原菌的方案如下：

a.本发明技术方案组(革兰氏阳性病原菌万古霉素和万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子组)富集捕获革兰氏阳性病原菌方案如实施例1，具体如下：

将1mg万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物加入到含革兰氏阳性病原菌离心管中，置于混匀仪上，以200rpm的转速室温孵育45min。将离心管插入常规磁力架分离6min。

b.万古霉素-磁性纳米粒子组富集捕获革兰氏阳性病原菌方案具体如下：

将1mg制备好的万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子加入到含革兰氏阳性病原菌离心管中，置于混匀仪上，以200rpm的转速室温孵育45min。最后，将离心管插入常规磁力架分离6min。

所述万古霉素修饰的磁性纳米粒子制备：(1)取2ml磁性纳米粒子(1)取2ml的磁性纳米粒子，加入到8mlph＝7.4的无菌的pbs溶液中，然后在外加磁场的作用下，对磁性纳米粒子进行洗涤，重复3次，将洗涤好的磁性纳米粒子重悬于10ml无菌的pbs溶液中；(2)5.8mgedc，溶于290μl无菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl无菌的pbs中，然后将溶解后的edc和nhss加入到洗涤过的磁性纳米粒子溶液中，活化1h；(3)将活化后磁性纳米粒子用无菌的pbs洗涤3次，重悬于8ml无菌的pbs溶液中；(4)称取91.3mg万古霉素，48.3mgedc和54.8mgnhss,分别溶于无菌的pbs溶液中，然后混合通过碳化二亚胺法，活化万古霉素表面羧基，活化10min；(5)将活化后的万古霉素加入到聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子中，孵育6h；(6)反应完毕后，用无菌的pbs洗涤3次，重悬于10ml无菌的pbs溶液中，得到浓度为2mg/ml万古霉素修饰的磁性纳米粒子。

c.聚乙二醇-磁性纳米粒子组

将1mg制备好的聚乙二醇-磁性纳米粒子加入到含革兰氏阳性病原菌离心管中，置于混匀仪上，以200rpm的转速室温孵育45min。最后，将离心管插入常规磁力架分离6min。

所述万古霉素修饰的磁性纳米粒子制备：取2ml的磁性纳米粒子，加入到8mlph＝7.4的无菌的pbs溶液中，然后在外加磁场的作用下，对磁性纳米粒子进行洗涤，重复3次，将洗涤好的磁性纳米粒子重悬于10ml无菌的pbs溶液中；(2)5.8mgedc，溶于290μl无菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl无菌的pbs中，然后将溶解后的edc和nhss加入到洗涤过的磁性纳米粒子溶液中，活化1h；(3)将活化后磁性纳米粒子用无菌的pbs洗涤3次，重悬于8ml无菌的pbs溶液中；(4)称取聚乙二醇90mg，溶解于1.8ml无菌的pbs溶液中，然后加入到活化后的磁性纳米粒子溶液中，反应3h，然后无菌的pbs洗涤3次，重悬于10ml无菌的pbs溶液中，得到聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子，得到浓度为2mg/ml的聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物，用于富集革兰氏阳性病原菌。

各组捕获率如下：

实验结果表明，万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子组的捕获革兰氏阳性病原菌效率明显高于万古霉素修饰的磁性纳米粒子组捕获效率，这说明聚乙二醇作为分子臂增加了万古霉素与革兰氏阳性病原菌的结合机会，使得革兰氏阳性病原菌的表面结合了更多的磁性纳米粒子，因此，在短时间内就能分离富集较多的革兰氏阳性病原菌。聚乙二醇-磁性纳米粒子组的捕获效率很低，说明对革兰氏阳性病原菌基本无非特异性捕获，表明用万古霉素分子来捕获革兰氏阳性病原菌具有良好的效果。

实施例3

待测样品为无菌裂解血，加入革兰氏阳性病原菌调节菌落浓度至10⁵cfu/ml备用。

将制备好万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子(1mg)分别加入到样品溶液(10ml)中，置于混匀仪上，以200rpm的转速室温孵育45min。然后常规磁力架分离6min。磁分离后，将上清液转入无菌离心管中，而分离得到的革兰氏阳性病原菌-万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物则用无菌pbs清洗两次，混合均匀，并用1ml无菌pbs溶液重悬革兰氏阳性病原菌-万古霉素-聚乙二醇-磁性纳米粒子复合物。捕获效率如实施例2方法获得，其余同实施例2。结果见表1，表明本方案能高效富集分离样品中的革兰氏阳性病原菌。

实施例4

待测样品为无菌血清，加入革兰氏阳性病原菌调节菌落浓度至10⁵cfu/ml。其余同实施例3。

实施例5

待测样品为无菌全血，加入革兰氏阳性病原菌调节菌落浓度至10⁵cfu/ml。其余同实施例3。

表1不同实际样品中革兰氏阳性病原菌分离效果的比较

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。