一种降解土壤中抗生素的混合菌剂及其制备方法与流程

文档序号:11144940阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种降解土壤中抗生素的混合菌剂,其特征在于,是由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液按(0.1-3)∶1的体积比混合而成。

2.根据权利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌剂,其特征在于,是由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液按0.1∶1的体积比混合而成。

3.根据权利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌剂,其特征在于,是由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液按0.5∶1的体积比混合而成。

4.根据权利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌剂,其特征在于,是由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液按1∶1的体积比混合而成。

5.根据权利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌剂,其特征在于,是由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液按1.5∶1的体积比混合而成。

6.根据权利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌剂,其特征在于,是由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液按2∶1的体积比混合而成。

7.根据权利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌剂,其特征在于,是由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液按2.5∶1的体积比混合而成。

8.根据权利要求1所述降解土壤中抗生素的混合菌剂,其特征在于,是由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液按3∶1的体积比混合而成。

9.一种如权利要求1-8中任一项所述降解土壤中抗生素的混合菌剂的制备方法,其特征在于,制备过程如下:

㈠、混悬液配制:取抗生素污染的土壤,按1:9的重量比加入到灭菌水中,搅拌成混悬液,备用;

㈡、菌落培养:

①、培养基制备:分别取NaCl 0.1g、KH2PO40.05g、K2HPO4 0.15g、NH3NO3 0.1g、MgSO4·7H2O 0.01g、琼脂1.5g,混合均匀,加蒸馏水至100ml,调节pH值至5.5~7.5,再高压灭菌后冷却至50℃,然后,加入土霉素,使其终质量浓度为100mg/L,即得土霉素基础盐固体培养基,备用;

②、培养:将混悬液用灭菌水10~120倍比稀释,然后涂布于土霉素基础盐固体培养基平板上,在25~37℃下,培养1~3天,成为培养菌落,备用;

㈢、菌株分离:在经过培养的土霉素基础盐固体培养基平板上挑取单菌落,通过平板划线,分离纯化出细菌菌株,再经生理生化和16S rDNA测序鉴定,保留枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)J5P2和假单胞菌(Pseudomonas sp.)J2,备用;

㈣、传代驯化:

①、驯化:将分离纯化的枯草芽孢杆菌J5P2菌株和假单胞菌J2菌株,再经土霉素基础盐固体培养基传代驯化,其方法是:将枯草芽孢杆菌J5P2菌株和假单胞菌J2菌株接种入质量浓度为100mg/L的土霉素基础盐固体培养基上,在25~37℃下培养1~3天后;再接种入质量浓度为200mg/L的土霉素基础盐固体培养基上,在25~37℃下培养1~3天,……,以此类推,连续传代培养,每次使土霉素质量浓度增加100mg/L,至土霉素最终质量浓度达500mg/L,完成传代驯化,分别成为驯化后的枯草芽孢杆菌J5P2菌株和假单胞菌J2菌株,备用;

②、LB培养基制备:分别取胰蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、氯化钠1g、琼脂1.5g,加蒸馏水至100mL,摇动容器,直至溶质溶解,用5mol/L的NaOH调节pH值至7.0,再用去离子水定容至1L,然后在15psi高压下蒸汽灭菌18-24min,即得LB培养基,备用;

③、保存:将驯化后的枯草芽孢杆菌J5P2菌株和假单胞菌J2菌株分别接种于LB培养基斜面,制成斜面菌种,-4℃保存,备用;

㈤、种菌液制备:在pH值5.5~7.5的条件下,取保存的枯草芽孢杆菌J5P2斜面菌种和假单胞菌J2斜面菌种,在土霉素质量浓度为100mg/L的土霉素基础盐培养基上活化24h~72h后,分别挑取枯草芽孢杆菌J5P2的单菌落和假单胞菌J2的单菌落接种于LB培养基中培养至对数生长期,5000r/min离心10min,收集菌体,经0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl洗涤3次,再用0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl调整菌液浓度,使其浓度为1×1010个/mL±0.5%,分别成枯草芽孢杆菌J5P2种菌液和假单胞菌J2种菌液,备用;

㈥、混合菌剂制备:将枯草芽孢杆菌J5P2种菌液和假单胞菌J2种菌液按(0.1~3)∶1的体积比混合,即成降解土壤中抗生素的混合菌剂。

10.根据权利要求9所述降解土壤中抗生素的混合菌剂的制备方法,其特征在于,制备过程如下:

㈠、混悬液配制:取抗生素污染的土壤,按1:9的重量比加入到灭菌水中,搅拌成混悬液,备用;

㈡、菌落培养:

①、培养基制备:分别取NaCl 0.1g、KH2PO40.05g、K2HPO4 0.15g、NH3NO3 0.1g、MgSO4·7H2O 0.01g、琼脂1.5g,混合均匀,加蒸馏水至100ml,调节pH值至6.5,再高压灭菌后冷却至50℃,然后,加入土霉素,使其终质量浓度为100mg/L,即得土霉素基础盐固体培养基,备用;

②、培养:将混悬液用灭菌水100倍比稀释,然后涂布于土霉素基础盐固体培养基平板上,在30℃下,培养2天,成为培养菌落,备用;

㈢、菌株分离:在经过培养的土霉素基础盐固体培养基平板上挑取单菌落,通过平板划线,分离纯化出细菌菌株,再经生理生化和16S rDNA测序鉴定,保留枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)J5P2和假单胞菌(Pseudomonas sp.)J2,备用;

㈣、传代驯化:

①、驯化:将分离纯化的枯草芽孢杆菌J5P2菌株和假单胞菌J2菌株,再经土霉素基础盐固体培养基传代驯化,其方法是:将枯草芽孢杆菌J5P2菌株和假单胞菌J2菌株接种入质量浓度为100mg/L的土霉素基础盐固体培养基上,在30℃下培养2天后;再接种入质量浓度为200mg/L的土霉素基础盐固体培养基上,在30℃下培养2天,……,以此类推,连续传代培养,每次使土霉素质量浓度增加100mg/L,至土霉素最终质量浓度达500mg/L,完成传代驯化,分别成为驯化后的枯草芽孢杆菌J5P2菌株和假单胞菌J2菌株,备用;

②、LB培养基制备:分别取胰蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、氯化钠1g、琼脂1.5g,加蒸馏水至100mL,摇动容器,直至溶质溶解,用5mol/L的NaOH调节pH值至7.0,再用去离子水定容至1L,然后在15psi高压下蒸汽灭菌21min,即得LB培养基,备用;

③、保存:将驯化后的枯草芽孢杆菌J5P2菌株和假单胞菌J2菌株分别接种于LB培养基斜面,制成斜面菌种,-4℃保存,备用;

㈤、种菌液制备:在pH值6.5的条件下,取保存的枯草芽孢杆菌J5P2斜面菌种和假单胞菌J2斜面菌种,在土霉素质量浓度为100mg/L的土霉素基础盐培养基上活化48h后,分别挑取枯草芽孢杆菌J5P2的单菌落和假单胞菌J2的单菌落接种于LB培养基中培养至对数生长期,5000r/min离心10min,收集菌体,经0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl洗涤3次,再用0.05mol/L、pH7.4的Tris-HCl调整菌液浓度,使其浓度为1×1010个/mL±0.5%,分别成枯草芽孢杆菌J5P2种菌液和假单胞菌J2种菌液,备用;

㈥、混合菌剂制备:将枯草芽孢杆菌J5P2种菌液和假单胞菌J2种菌液按(0.1~3)∶1的体积比混合,即成降解土壤中抗生素的混合菌剂。

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