粳稻ALS突变型基因及其蛋白在抗除草剂方面的应用的制作方法

本发明属于植物蛋白和植物抗除草剂领域。具体而言，本发明涉及粳稻的乙酰乳酸合成酶(ALS)突变蛋白，该突变蛋白能赋予植物尤其水稻抗乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂的特性。本发明公开了该突变蛋白的序列，以及它们在植物抗除草剂领域中的应用。

背景技术：

乙酰乳酸合成酶(ALS)(也称乙酰羟酸合成酶，AHAS；EC 4.1.3.18)，是植物和微生物3种氨基酸生物合成过程中的关键酶。如果此酶的活力受到抑制或者丧失，会导致植物缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成受阻，影响蛋白的合成，最终导致植物生长受阻，直至死亡。因此，以ALS为作用靶标开发了多种高效除草剂，主要包括磺酰脲类(Sulfonylureas,SU)、咪唑啉酮类(Imidazolinones,IMI)、三唑嘧啶类(Triazolopyrimidines,TP)、嘧啶氧(硫)苯甲酸类[Pyrimidinylthio(or oxy)–benzoates,PTB；pyrimidinyl-carboxyherbicides；PCs]和磺酰胺基羰基三唑啉酮类(Sulfonylamino-carbonyltriazolinones,SCT)等13类化合物。这些除草剂统称为ALS抑制剂类除草剂或ALS类除草剂，这类除草剂具有选择性强、杀草谱广、低毒高效等特点，目前已大面积推广使用。但这些除草剂属于选择性除草剂，在杀草的同时，也会对一般不具有抗(耐)除草剂特性的农作物本身产生药害，极大限制了其使用时间和使用空间，如需要在农作物播种前一段时间使用除草剂才能避免农作物遭受药害。培育抗(耐)除草剂作物品种可减少作物药害、拓宽除草剂的使用范围。

ALS属于依赖硫胺素焦磷酸酶的家族，在植物、真菌以及藻类等体内均已被发现。该酶由催化亚基和调节亚基构成，催化亚基分子量约为65kD，调节亚基在9-54kD之间。对于实现ALS的全酶活性，除了这2个亚基之外，还依赖于3个必不可少的辅助因子，ThDP、二价金属离子和黄素嘌呤二核苷酸。成熟的ALS蛋白大约由670个氨基酸组成，其序列在不同物种间高度保守。ALS蛋白在Gly 95、Ala 96、Ala 122、Pro 171、Pro 196、Pro 197、Ala 205、Asp 376、Trp 537、Trp 548、Trp 552、Trp 557、Trp 563、Trp 574、Ser 621、Ser 627、Ser 638、Ser 653、Gly 654、Val 669等氨基酸位点(以模式植物拟南芥的ALS氨基酸位置计算)发生突变可以产生ALS抑制剂类除草剂抗性，这在多种农作物(包括玉米、小麦、水稻、油菜、向日葵等)、模式植物拟南芥和上百种杂草中均有报道。而且，不同位点的氨基酸残基变异产生不同类型的ALS抑制剂类除草剂抗性。

其中，水稻已知的抗ALS抑制剂突变位点包括Gly 95、Ala 96、Ala 122、Trp 548、Ser 627、Ser 653和Gly 654。ALS突变体抗除草剂水平与ALS氨基酸突变的位置有关，还与突变后的氨基酸种类及突变氨基酸的数目有关。有些研究还表明，氨基酸变异引起的ALS突变酶对抑制剂类除草剂产生抗性的同时，有些ALS突变酶的酶学特性也有所改变。

目前，ALS抑制剂类除草剂的作用机理尚未确定，很难提前预测ALS蛋白其它氨基酸位点的突变是否会产生除草剂抗性，只能依赖于科研人员长期、艰苦的实践探索，并凭借一些运气才可能发现ALS蛋白新的除草剂抗性位点。

而且目前国内外也没有人研究报道过关于粳稻中ALS位点突变的情况。

技术实现要素：

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种粳稻的ALS突变型基因。

本发明还要解决的技术问题是提供上述粳稻的ALS突变型基因所编码的ALS突变蛋白。

本发明还要解决的技术问题是提供了含有上述的粳稻的ALS突变型基因的表达盒、重组载体或细胞。

本发明还要解决的技术问题是提供了上述粳稻的ALS突变型基因、突变蛋白、表达盒、重组载体或细胞在制备绿色植物除草剂方面的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了获得具有除草剂抗性的绿色植物的方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供了鉴定具有除草剂抗性的绿色植物的方法。

本发明人通过对粳稻品种镇稻18植株进行长期、不断地EMS突变的筛选，发现了一个新的ALS突变蛋白，其对ALS抑制剂类除草剂不敏感，从而使得植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性。本发明在植物育种中的应用，可用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，本发明还开发了这些蛋白及其编码基因在转基因水稻中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种粳稻的ALS突变型基因，其在粳稻的ALS基因序列的第536位核苷酸由C突变为T。

上述粳稻的ALS突变型基因其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

上述的粳稻的ALS突变型基因所编码的ALS突变型蛋白。该突变来源于粳稻品种镇稻18，与对ALS抑制剂类除草剂敏感的野生型水稻粳稻ALS(如Genbank登录号XM_015770973.1)相比，其氨基酸在Ala179位点突变。目前还没有报道表明，在来自水稻粳稻的ALS的Ala179位点突变，氨基酸Ala突变为氨基酸Val，会使得粳稻具有ALS抑制剂类除草剂抗性。

上述的粳稻的ALS突变蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明内容还包括表达盒、重组载体或细胞，其含有上述的粳稻的ALS突变型基因。

本发明内容还包括上述的粳稻的ALS突变型基因、蛋白、表达盒、重组载体或细胞在绿色植物抗除草剂方面的应用。

上述绿色植物为水稻等。

本发明内容还包括获得具有除草剂抗性的绿色植物的方法，包括如下步骤：

1)使绿色植物包含所述的粳稻的ALS突变型基因；或

2)使绿色植物表达所述的粳稻的ALS突变型蛋白。

上述的方法，包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。

鉴定权利要求上述的方法获得的绿色植物的方法，包括以下步骤：

1)测定所述绿色植物是否包含上述的粳稻的ALS突变型基因；或，

2)测定所述绿色植物是否表达上述的粳稻的ALS突变型蛋白。

有益效果：田间喷施ALS抑制剂类除草剂“百垄通”的实验结果表明，含有本发明的粳稻的ALS突变蛋白的植物3-4叶幼苗在施用3mL百垄通/L水(9倍推荐使用浓度)后，植株仍然正常生长发育和结实，而野生型粳稻3-4叶幼苗在施用1mL百垄通/3L水(1倍推荐使用浓度)30天后表现为整株死亡。

附图说明

图1百垄通除草剂筛选获得的抗性水稻粳稻突变体；

图2 PCR扩增镇稻18突变体的ALS基因结果图；第1泳道为Marker；Marker分子量从上到下依次为8kb、5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp，第2泳道为镇稻18野生型水稻DNA，第3泳道为抗除草剂镇稻18突变植株的DNA；目的片段长度1935bp；

图3为百垄通除草剂对野生型和抗除草剂突变植株的ALS酶活性抑制；

图4百垄通除草剂对野生型和抗除草剂镇稻18突变体植株的ALS酶活性抑制的吸光值测定；

图5突变体植株的ALS基因的过量表达载体BamHI/SacI双酶切验证图；第1泳道为Marker；Marker分子量从上到下依次为8kb、5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp，第2泳道为重组载体经BamHI/SacI双酶切后产生的基因片段和质粒片段DNA，基因片段大小符合预期，证明载体构建成功；

图6突变型ALS基因水稻PCR检测图；总共有11个泳道，第1泳道为Marker；Marker分子量从上到下依次为8kb、5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp，第2泳道为质粒DNA，作为阳性对照，第3～11泳道为突变植株的转基因DNA。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：水稻粳稻镇稻18抗咪唑啉酮类除草剂突变体获取过程(百垄通)

将粳稻常规水稻镇稻种子镇稻18(此为M0，用清水浸泡2小时)150kg分6次用0.5-1.0％(w/w)甲磺酸乙酯(EMS)室温下浸泡6-9小时，期间每1小时摇动一次种子；弃去EMS溶液，自来水翻动浸泡种子5次，每次5分钟，然后用自来水冲洗种子过夜，次日进行田间播种，并进行常规肥水管理(此为M1)。植株成熟后，种子混收、晾干，过冬保存。次年播种田间。待水稻(此为M2)幼苗长至3-4叶期时，喷施为3mL百垄通/L水(“百垄通”是德国巴斯夫公司生产一种水剂型咪唑啉酮类除草剂，推荐最低使用浓度为1mL百垄通/1.5～3L水)，30天后还呈正常绿色植株即为抗咪唑啉酮类除草剂的粳稻突变植株(图1)。共计获得抗除草剂的M2单株421株，这些抗性单株进行常规肥水管理，有385个M2单株可正常结实，种子成熟后，单株收种、晾干，过冬保存。

实施例2：抗咪唑啉酮类除草剂粳稻突变体突变位点分析

取上述实施例1获得的抗除草剂粳稻突变植株选取突变植株的叶片，分别提取基因组DNA，送上海翰宇生物科技有限公司进行基因组测序。测序结果与粳稻参考基因序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/XM_015770973.1)相比，发现上述抗除草剂粳稻突变体在ALS基因上发生了1个位点的突变，其中抗除草剂突变植株在ALS基因的第536位点碱基发生突变，由C变成T，导致其相应编码的氨基酸序列的第179位点由丙氨酸变为缬氨酸，即抗除草剂突变植株的ALS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的ALS突变型蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的突变植株水稻种子zhen4其分类命名为水稻种子zhen4(Oryza sativa Japonica Group zhen 4)，该植株已于2017年2月12号保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072，保藏编号为CCTCC No：P201705。该保藏的水稻种子与普通水稻种子的培养条件一致，喜高温、多湿、短日照，对土壤要求不严，在20-32℃、湿润的土壤(pH 5.5-7.5)、正常日照条件下都可较好地生长。将水稻种子用清水浸泡后，置于恒温培养箱25-30℃培养48小时，早晚各换一次水；接着将水稻种子放在垫有湿纱布的平皿中，盖上盖子，放在恒温培养箱25-30℃培养，大约3-4天就可检测发芽情况。

实施例3抗咪唑啉酮类除草剂粳稻突变体ALS基因克隆

取上述抗除草剂粳稻突变体zhen4的叶片，分别提取突变体zhen4的基因组DNA。根据水稻粳稻野生型ALS基因(如Genbank登录号XM_015770973.1)所在的染色体序列设计扩增ALS基因的特异引物为：正向引物F5’-ATCCGAGCCACACATCGCCTCAC-3’、反向引物R5’-CTCTTTATGGGTCATTCAGGTCAA-3’。

采用OneTaq^TM Quick2×Master Mix(购自NEB公司，货号：M0483L)扩增ALS基因5’端序列、3’端序列，其反应体系如下：

PCR扩增反应程序采用两步法，退火和延伸合为一起，采用68度。

程序如下：预变性：98℃3min；35个循环：变性98℃10sec；延伸68℃1min；保温：72℃10min。

取2μl PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，发现有预期大小的片段后(图2)，剩余的PCR产物经PCR清洁试剂盒(购自Axygen公司)清洁回收后，克隆至pMD19-T载体(购自Takara公司)，然后转化大肠杆菌。每个转化随机挑取12个大肠杆菌单克隆进行PCR检测，取PCR结果呈阳性的6个单克隆，送金斯瑞生物科技有限公司测序，获得突变的ALS基因序列。

实施例4粳稻M3突变体抗咪唑啉酮类除草剂(百垄通)

将zhen4收获的种子播种出苗(此为M3)，待M3粳稻幼苗长至3-4叶期时，喷施4mL百垄通/L水(推荐最低使用浓度为1mL百垄通/3L水，相当于12倍浓度)。喷施除草剂15天后，抗性苗M3呈正常绿色、能继续长高至20-30cm，而非抗性苗叶片失去绿色甚至部分枯黄，植株不长高，只有5-9cm。30天后，M3抗性株呈正常绿色植株，而喷施同样浓度除草剂的野生型粳稻都已全部枯死，表明突变粳稻至少抗12倍浓度的百垄通除草剂。

实施例5粳稻M3突变体的ALS酶活测定

为了验证粳稻突变体的除草剂抗性是否由上述的ALS突变所致，本发明人进行了ALS酶活性测定。测定方法参照Singh等的方法(Singh B.K.,Stidham M.A.,Shaner D.L.Assay of acetohydroxyacid synthase.Analytical Biochemistry,1988,171:173-179.)。具体的，分别取野生型粳稻和zhen4的M3植株叶片0.2g，在研钵中用液氮研磨粉碎，加入2mL提取液(100mM K₂HPO₄，pH 7.5、10mM丙酮酸钠、5mM EDTA、1mM缬氨酸、1mM亮氨酸、10mM半胱氨酸、0.1mM黄素腺嘌呤二核苷酸、5mM氯化镁、10％(V/V)甘油、1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮)，待提取液解冻后继续研磨1min左右。12000rpm、4℃离心30min，吸取上清液，加入硫酸铵使之达到50％饱和度，于冰上放置半小时，12000rpm、4℃离心30min，弃上清，将沉淀溶解于0.2mL反应缓冲液(100mM K₂HPO₄，pH 7.0、1mM EDTA、10mM氯化镁、100mM丙酮酸钠、1mM焦磷酸硫胺素、0.1mM黄素腺嘌呤二核苷酸)，分别得各植株的ALS提取液。

在获得的ALS提取液中分别加入10μL除草剂“百垄通”(水剂，有效成分240g/L)，混匀，37℃孵育1h，加0.1ml 3M硫酸终止反应，反应混合物在60℃反应孵育30分钟便于脱羧，然后加0.4mL显色液(0.09g/L 1-萘酚和0.009g/L肌酸，用2.5M NaOH溶解)得到混合物液。混合液在37℃孵育30分钟进行显色(ALS催化丙酮酸形成乙酰乳酸，乙酰乳酸脱羧形成3-羟基丁酮，再与肌酸和1-萘酚形成粉红色复合物，该复合物在530nm处有最大吸收值)，随后测定其530nm的吸光度，ALS活性用A530吸光值表示，A530吸光值的高低反映ALS活性的高低。实验以水为对照，野生型、zhen4株系都各测5个单株。

A530吸光值测定结果发现，当野生型、zhen4的ALS提取液中没有ALS抑制剂百垄通时，它们的A530吸光值均在1.3-1.4间，表明野生型和突变体的ALS酶活性无显著性差异(图3，4)；而加入ALS抑制剂百垄通后，野生型的A530吸光值仅为0.28，zhen4的A530吸光值为1.15，即野生型的ALS酶活性仅为对照的25.4％，而zhen4的ALS酶活性仍有83％(图3，4)，突变体的ALS酶活性是野生型的3倍多，表明zhen4的突变ALS对百垄通不敏感，从而赋予了抗性。

实施例6转基因ALS水稻抗百垄通

设计特异引物5’-CGCGGATCCATCCGAGCCACACATCGCCTC-3’和5’-TCCCCGCGGCCTACGGAAAACAACACAC-3’，其5’分别加入BamHI和SacI酶切修饰位点。参考实施例3的方法，通过PCR从上述粳稻18突变体zhen4的基因组DNA中扩增出突变ALS基因，测序正确后，用BamHI和SacI分别双酶切突变ALS基因片段和植物表达载体pCAMBIA1301质粒(购自pcambia公司)，酶切产物用T4-DNA酶(购自TaKaRa公司)连接，连接产物转化大肠杆菌。重组质粒提取DNA，用BamHI和SacI双酶切验证，可以产生大的质粒片段和小的基因片段(图5)，证明已将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ALS基因克隆至植物表达载体pCAMBIA1301质粒(购自pcambia公司)中。将构建好的质粒载体转化农杆菌EHA105，培养菌体。采用常规的农杆菌介导法转化粳型水稻日本晴(购自江苏省农业种质资源保护与利用平台)，获得转基因植株收种后，后代植株长至3-4叶期时，PCR检测转基因植株(图6)。PCR检测引物为正向引物35SF 5’-ATGGTTAGAGAGGCTTACGC-3’，反向引物5R 5’-AGCAACAGGTCAGCCTTATCCAC-3’，扩增片段涵括CaMV35S启动子和ALS基因的5’端序列，大小约2kb。PCR扩增反应体系参考实施例3，PCR扩增反应程序采用两步法，退火和延伸合为一起，采用68度。扩增程序如下：预变性：98℃3min；30个循环：变性98℃10sec；延伸68℃2min；保温：72℃10min。经PCR鉴定呈阳性后，喷施4mL百垄通/L水(12倍推荐使用浓度)，7天后，参照实施例6所述方法测定ALS酶活性，发现转基因水稻的ALS酶活性显著高于野生型镇稻18的ALS酶活64％；30天后发现转基因水稻生长状态良好，而非转基因野生型镇稻18则全部枯死。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些均在本发明的保护范围内。本发明的全部范围由所附专利要求极其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 粳稻的ALS突变型基因及其蛋白在抗除草剂方面的应用

<130> SG20170221002

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1935

<212> DNA

<213>镇稻18 ALS突变型基因

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1935)

<400> 1

atg gct acg acc gcc gcg gcc gcg gcc gcc gcc ctg tcc gcc gcc gcg 48

Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala

1 5 10 15

acg gcc aag acc ggc cgt aag aac cac cag cga cac cac gtc ctt ccc 96

Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro

20 25 30

gct cga ggc cgg gtg ggg gcg gcg gcg gtc agg tgc tcg gcg gtg tcc 144

Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser

35 40 45

ccg gtc acc ccg ccg tcc ccg gcg ccg ccg gcc acg ccg ctc cgg ccg 192

Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro

50 55 60

tgg ggg ccg gcc gag ccc cgc aag ggc gcg gac atc ctc gtg gag gcg 240

Trp Gly Pro Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala

65 70 75 80

ctg gag cgg tgc ggc gtc agc gac gtg ttc gcc tac ccg ggc ggc gcg 288

Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala

85 90 95

tcc atg gag atc cac cag gcg ctg acg cgc tcc ccg gtc atc acc aac 336

Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn

100 105 110

cac ctc ttc cgc cac gag cag ggc gag gcg ttc gcg gcg tcc ggg tac 384

His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr

115 120 125

gcg cgc gcg tcc ggc cgc gtc ggg gtc tgc gtc gcc acc tcc ggc ccc 432

Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro

130 135 140

ggg gca acc aac ctc gtg tcc gcg ctc gcc gac gcg ctg ctc gac tcc 480

Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser

145 150 155 160

gtc ccg atg gtc gcc atc acg ggc cag gtc ccc cgc cgc atg atc ggc 528

Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly

165 170 175

acc gac gtc ttc cag gag acg ccc ata gtc gag gtc acc cgc tcc atc 576

Thr Asp Val Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile

180 185 190

acc aag cac aat tac ctt gtc ctt gat gtg gag gac atc ccc cgc gtc 624

Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val

195 200 205

ata cag gaa gcc ttc ttc ctc gcg tcc tcg ggc cgt cct ggc ccg gtg 672

Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val

210 215 220

ctg gtc gac atc ccc aag gac atc cag cag cag atg gcc gtg ccg gtc 720

Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val

225 230 235 240

tgg gac acc tcg atg aat cta cca ggg tac atc gca cgc ctg ccc aag 768

Trp Asp Thr Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys

245 250 255

cca ccc gcg aca gaa ttg ctt gag cag gtc ttg cgt ctg gtt ggc gag 816

Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu

260 265 270

tca cgg cgc ccg att ctc tat gtc ggt ggt ggc tgc tct gca tct ggt 864

Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala Ser Gly

275 280 285

gac gaa ttg cgc tgg ttt gtt gag ctg act ggt atc cca gtt aca acc 912

Asp Glu Leu Arg Trp Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr

290 295 300

act ctg atg ggc ctc ggc aat ttc ccc agt gac gac ccg ttg tcc ctg 960

Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu

305 310 315 320

cgc atg ctt ggg atg cat ggc acg gtg tac gca aat tat gcc gtg gat 1008

Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp

325 330 335

aag gct gac ctg ttg ctt gcg ttt ggt gtg cgg ttt gat gat cgt gtg 1056

Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val

340 345 350

aca ggg aaa att gag gct ttt gca agc agg gcc aag att gtg cac att 1104

Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile

355 360 365

gac att gat cca gca gag att gga aag aac aag caa cca cat gtg tca 1152

Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser

370 375 380

att tgc gca gat gtt aag ctt gct tta cag ggc ttg aat gct ctg cta 1200

Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ala Leu Leu

385 390 395 400

caa cag agc aca aca aag aca agt tct gat ttt agt gca tgg cac aat 1248

Gln Gln Ser Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His Asn

405 410 415

gag ttg gac cag cag aag agg gag ttt cct ctg ggg tac aaa act ttt 1296

Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe

420 425 430

ggt gaa gag atc cca ccg caa tat gcc att cag gtg ctg gat gag ctg 1344

Gly Glu Glu Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu

435 440 445

acg aaa ggt gag gca atc atc gct act ggt gtt ggg cag cac cag atg 1392

Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met

450 455 460

tgg gcg gca caa tat tac acc tac aag cgg cca cgg cag tgg ctg tct 1440

Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser

465 470 475 480

tcg gct ggt ctg ggc gca atg gga ttt ggg ctg cct gct gca gct ggt 1488

Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly

485 490 495

gct tct gtg gct aac cca ggt gtc aca gtt gtt gat att gat ggg gat 1536

Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp

500 505 510

ggt agc ttc ctc atg aac att cag gag ctg gca ttg atc cgc att gag 1584

Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg Ile Glu

515 520 525

aac ctc cct gtg aag gtg atg gtg ttg aac aac caa cat ttg ggt atg 1632

Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met

530 535 540

gtg gtg caa tgg gag gat agg ttt tac aag gcg aat agg gcg cat aca 1680

Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr

545 550 555 560

tac ttg ggc aac ccg gaa tgt gag agc gag ata tat cca gat ttt gtg 1728

Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val

565 570 575

act att gct aag ggg ttc aat att cct gca gtc cgt gta aca aag aag 1776

Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys

580 585 590

agt gaa gtc cgt gcc gcc atc aag aag atg ctc gag act cca ggg cca 1824

Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro

595 600 605

tac ttg ttg gat atc atc gtc ccg cac cag gag cat gtg ctg cct atg 1872

Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met

610 615 620

atc cca agt ggg ggc gca ttc aag gac atg atc ctg gat ggt gat ggc 1920

Ile Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly

625 630 635 640

agg act gtg tat taa 1935

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<212> PRT

<213>镇稻18 ALS突变型基因

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Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro

20 25 30

Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser

35 40 45

Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro

50 55 60

Trp Gly Pro Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala

65 70 75 80

Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala

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Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn

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His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr

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Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro

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Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser

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Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val

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Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val

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Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met

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<212> DNA

<213> 扩增ALS基因的特异引物正向引物

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<213> PCR检测引物正向引物 35SF

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<212> DNA

<213> PCR检测引物反向引物5R

<400> 6

agcaacaggt cagccttatc cac 23