本发明属于中药材鉴定技术领域，具体涉及一种用于鉴定金钱白花蛇的特异性引物、试剂盒及鉴别方法。
背景技术：
金钱白花蛇为《中国药典》2015年版一部收载的一种常用药材，来源于眼镜蛇科动物银环蛇(Bungarus multicinctus Blyth)的幼蛇干燥体，具有祛风、通络、止痉的功效。临床用于治疗风湿顽痹，麻木拘挛，中风口眼斜，半身不遂，抽搐痉挛，破伤风，麻风等病症。
金钱白花蛇作为一种常用的名贵中药材，主要分布于我国浙江、广东、广西、云南和贵州等省份。近年来，由于生态环境不断地恶化以及金钱白花蛇产卵率较低等因素致使其药材资源急剧减少，又鉴于其疗效确切，使用量大，饲养条件和技术要求严格，导致金钱白花蛇价格节节攀升。在利益驱使下，一些不法商家以次充好，使得商品中常充斥着混杂和伪品。比较常见的伪品有赤链蛇、铅色水蛇和金环蛇等。针对金钱白花蛇严重的造假情况，研究人员利用分子生物学PCR技术来对金钱白花蛇真伪进行鉴别，如中国专利文CN101613759A中公开的鉴定金钱白花蛇的PCR方法及其特异引物，通过对金钱白花蛇的CYTB基因片段设计引物并进行PCR特异性扩增、电泳检测即可完成对样品真伪的鉴别。然而上述方案中采用的引物进行扩增的产物分子量为565bp，分子量大，导致其电泳时间长，检测效率低，并且鉴定结果准确度和灵敏度低、种属特异性差，对于种属相近的蛇鉴别困难。
技术实现要素：
本发明要解决的第一个技术问题在于提供一种用于鉴定中药金钱白花蛇的特异性引物，采用所述引物鉴定中药金钱白花蛇，鉴定结果准确、稳定、可靠、特异性强和灵敏度高，能够在短时间内对大量待测中药金钱白花蛇进行快速鉴定。
本发明要解决的第二个技术问题在于提供一种用于鉴定中药金钱白花蛇的试剂盒，采用所述试剂盒鉴定中药金钱白花蛇，鉴定结果准确、稳定、可靠、特异性强和灵敏度高，能够在短时间内对大量待测中药金钱白花蛇进行快速鉴定。
本发明要解决的第三个技术问题在于提供一种用于鉴定中药金钱白花蛇的方法，采用所述方法鉴定中药金钱白花蛇，鉴定结果准确、稳定、可靠、特异性强和灵敏度高，能够在短时间内对大量待测中药金钱白花蛇进行快速鉴定。
为此，本发明提供了一种用于鉴定中药金钱白花蛇的引物，所述引物序列如下：
上游引物：5′-CCCGCTCCATAACCTTTCGT-3′；
下游引物：5′-TCAGTTCAGCCGAGTAAGGG-3′。
本发明提供了一种用于鉴定中药金钱白花蛇的试剂盒，含有所述的引物。
本发明所述的试剂盒，每支所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和PCR反应液部分；所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的含Mg2+扩增缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶以及ddH2O。
本发明提供了一种所述的引物或所述的试剂盒在鉴定中药金钱白花蛇中的应用。
本发明提供了一种鉴定中药金钱白花蛇的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测中药金钱白花蛇的总DNA，备用；
(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：
上游引物:5′-CCCGCTCCATAACCTTTCGT-3′；
下游引物:5′-TCAGTTCAGCCGAGTAAGGG-3′。
(3)测定步骤(2)中所得的PCR扩增产物的大小，若所述PCR扩增产物中含有100～250bp的DNA片段，则所述待测中药金钱白花蛇为真；反之，则所述待测中药金钱白花蛇为假。
所述的方法，所述步骤(2)中，所述PCR反应体系包括：
DNA模板，100ng，2μL；
上游引物，10μM，1μL；
下游引物，10μM，1μL；
2×EasyPCR SuperMix，10μL；
ddH2O，8μL；
反应总体积为22μL。
(4)所述的方法步骤(2)中，PCR扩增程序如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，然后继续72℃延伸5min，降温至4℃，获得的扩增产物4℃保存。所述的方法(3)中100～250bp的DNA片段为181bp。所述的方法181bp的DNA片段序列如SEQ.ID NO：3所示。
本发明技术方案，具有如下优点：
(1)本发明所述的用于鉴定中药金钱白花蛇的特异性引物，基于金钱白花蛇的CYTB基因设计了大量的引物，通过对大量引物筛选研究，筛选出了具有种属特异性的引物，使用上述引物对待测中药金钱白花蛇进行鉴定，能将金钱白花蛇药材与其他混淆品准确的分开，且其PCR扩增产物仅为100～250bp，分子量小，保证了其能在短时间内进行大量的中药金钱白花蛇鉴定，同时鉴定结果显示，此方法具有准确、稳定、可靠、特异性强和灵敏度高等优点，可广泛适用于中药金钱白花蛇的鉴定。
(2)本发明所述的用于鉴定中药金钱白花蛇的试剂盒，所述试剂盒中含有所述的用于鉴定中药金钱白花蛇的特异性引物，所述引物具有种属特异性，使用上述引物对待测中药金钱白花蛇进行鉴定，能将金钱白花蛇药材与其他混淆品准确的分开，在短时间内进行大量的中药金钱白花蛇鉴定，同时鉴定结果显示，此方法具有准确、稳定、可靠、特异性强和灵敏度高等优点，可广泛适用于中药金钱白花蛇的鉴定。
(3)本发明所述的鉴定中药金钱白花蛇的方法，采用本发明设计的引物进行PCR扩增，若所述PCR扩增产物中含有100～250bp的DNA片段，且所述100～250bp的DNA片段为181bp的DNA片段，则所述待测中药金钱白花蛇为真；反之，则所述待测中药金钱白花蛇为假；所述方法能将金钱白花蛇药材与其他混淆品准确的分开。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见的，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例3中的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明下述实施中所使用的主要试剂如下：
EasyGenomic DNA Kit、2×EasyPCR SuperMix(+dye)和Trans2K Plus DNA Marker均购自北京全式金生物技术公司。
本发明下述实施中所使用的主要设备如下：
ST16R高速冷冻离心机购自赛默飞世尔、V-GES电泳仪购自威泰克、Dolphin View凝胶成像系统购自威泰克。
实施例1
本实施例提供了一种用于鉴定中药金钱白花蛇的特异性引物，针对金钱白花蛇的CYTB基因设计的特异性引物如下，参见序列表中SEQ ID NO：1-2所示：
上游引物：5′-CCCGCTCCATAACCTTTCGT-3′；
下游引物：5′-TCAGTTCAGCCGAGTAAGGG-3′；
上述引物由上海英潍捷基公司(北京合成部)合成。
实施例2
本实施例提供了一种用于鉴定中药金钱白花蛇的试剂盒，每支所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和PCR反应液部分；所述引物液为含所述实施例1中的所述特异性引物；所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的含Mg2+扩增缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶以及ddH2O，每支所述试剂盒的配方为：
上游引物，10μM，1μL；
下游引物，10μM，1μL；
2×EasyPCR SuperMix，10μL；
ddH2O，8μL；
总体积为20μL。
实施例3
本实施例3提供了一种利用实施例1的特异性引物或实施例2的试剂盒鉴定中药金钱白花蛇的方法，包括如下步骤：
(1)药材收集于浙江、江西、广西和四川等省份(表1)，表1中试验所有的样品均为市售产品，可以通过购买得到，或是自来源地采集或购买。
表1金钱白花蛇及其常见伪品样品来源
选取上表1中的样品的冻干粉采用EasyGenomic DNA Kit进行总DNA的提取，按照说明书操作，步骤如下：
(1)总DNA提取制备
1)分别称取各样品的冻干粉≤25mg，置于无菌的1.5mL离心管中；
2)分别加入100μL的LB2(裂解液)和20μL的Proteinase K(蛋白酶K)；
3)55℃金属浴孵育1小时至DNA完全裂解，每15min颠倒混匀一次；
4)加入20μL的RNase A(RNA酶)于样品中，室温孵育2min，除去RNA的干扰；
5)12000rpm离心5min，转移上清液于无菌的离心管中；
6)加入500μL的BB2(结合缓冲液)，立即涡旋5s，室温孵育10min；
7)将全部的溶液加入离心柱中，12000rpm离心30s，弃去流出液；
8)加入500μL的CB2(清洗缓冲液)，12000rpm离心30s，弃去流出液；
9)重复步骤8)一次；
10)加入500μL的WB2(洗涤缓冲液)，12000rpm离心30s，弃去流出液；
11)重复步骤10)一次；
12)12000rpm离心2min，彻底去除残留的WB2；
13)将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入50μL 65℃预热EB(洗脱缓冲液)，室温静置1min，12000rpm离心1min，洗脱DNA，洗脱出的DNA作为供试品溶液，置于-20℃保存。
(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：
上游引物：5′-CCCGCTCCATAACCTTTCGT-3′；
下游引物：5′-TCAGTTCAGCCGAGTAAGGG-3′。
所述PCR反应体系包括：
DNA模板，100ng，2μL；
上游引物，10μM，1μL；
下游引物，10μM，1μL；
2×EasyPCR SuperMix，10μL；
ddH2O，8μL；
反应总体积为22μL。
所述PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，然后继续72℃延伸5min，降温至4℃，获得的扩增产物4℃保存。
(3)取步骤(2)中的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用V-GES电泳仪，测得各样品的PCR扩增产物的大小，琼脂糖凝胶电泳法按照2015年版中国药典三部附录ⅣB，胶浓度为1％，TAE电泳缓冲液(Tris-EDTA-乙酸缓冲液，pH 8.3)，上述步骤(2)中获得的各样品的PCR反应溶液的上样量分别为10μL，DNA分子量标记(Trans2K Plus DNA Marker)上样量为2μL，电泳结束后，取凝胶在溴化乙锭溶液(0.5μg/mL)中染色20min，在Dolphin View凝胶成像系统上观察结果，其中1为DNA Marker，2为金钱白花蛇，3为金环蛇，4为赤链蛇，5为铅色水蛇，6为虎斑颈槽蛇(图1)，金钱白花蛇的冻干粉的PCR反应液在100～250bp有一条DNA条带，所述DNA条带为引物设计的PCR产物大小(181bp)，而金环蛇、赤链蛇、铅色水蛇和虎斑颈槽蛇没有条带，表明本发明设计的引物具有种属特异性，采用该特异性引物、试剂盒及鉴别方法能准确的将金钱白花蛇药材与其他混淆品分开，并且扩增的DNA片段仅为181bp，分子量小，检测速率快，采用EasyGenomic DNA Kit纯化回收所述PCR扩增产物，然后由上海英潍捷基公司(北京合成部)进行测序，所述的181bp的DNA片段序列如SEQ.ID NO：3所示。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京建生药业有限公司
<120> 用于鉴定金钱白花蛇的特异性引物、试剂盒及鉴别方法
<130> HA201602556
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cccgctccat aacctttcgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcagttcagc cgagtaaggg 20
<210> 3
<211> 181
<212> DNA
<213> 金钱白花蛇Bungarus multicinctus
<400> 3
cccgctccat aacctttcgt ccatttatac aaatcctatt ttgaacatta gtctcaacct 60
ttattattat tacatgaaca gccactaaac ctgtagaatc gccattcatt cttatcagcc 120
aaacaacttc aattatctac ttctccttct ttattattaa tcccttactc ggctgaactg 180
a 181