(一)技术领域
本发明涉及一种脂肪酶催化红花油醇解制备脂肪酸乙酯的方法。
(二)
背景技术：
红花油又名红花籽油，是以红花籽为原料制取的油品。标准型红花籽油的脂肪酸中油酸的含量为11～15％，亚油酸最多，含量为69～79％，棕榈酸的含量为5～9％，硬脂酸的含量为1～4.9％，碘价在140左右，属于干性油类。在工业上多被用作制油漆的原料，用于奶牛饲料则可以提高牛奶的亚油酸含量。而且红花油具有很高的医用价值，所以不论医用、食用还是制备亚油酸乙酯都是良好的原料。
长链脂肪酸乙酯具有优良的性状，在化妆品行业、医药、塑料、纺织、皮革等行业有着广泛的应用，其也被用作脂肪酸衍生物的中间体。目前国内外制备脂肪酸乙酯分为两类，包括脂肪酸乙酯化和油脂醇解。又依据催化剂的区别分为化学法和酶法。以游离酸制备脂肪酸乙酯能耗高，费时且环境污染大，而油脂醇解要优于脂肪酸乙酯化。工业上碱催化油脂乙醇解反应制备脂肪酸乙酯通常使用价格低廉的氢氧化钠或氢氧化钾为催化剂。
刘润哲等以红花油和无水乙醇为反应底物，氢氧化钠为催化剂进行醇解反应，反应1h后脂肪酸乙酯含量达到90％左右。毕艳兰等利用氢氧化钠催化红花油醇解反应，通过响应面法优化，得出反应时间50min，脂肪酸乙酯含量可以达到95.1％。
相对于化学法，利用酶法催化红花油制备脂肪酸乙酯具有副产物少，下游处理简单等优势，具有广阔的应用前景。
(三)
技术实现要素：
本发明目的是为了解决化学方法的不足，利用脂肪酶催化红花油制备脂肪酸乙酯，该方法未见文献报道，而且生产工艺条件温和，步骤简单，产品收率高，环境友好，节能环保等优点。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种酶催化红花油醇解制备脂肪酸乙酯的方法，所述方法是以红花油和乙醇为反应底物，以能溶解反应底物的有机溶剂为反应介质，在脂肪酶的作用下，于25-60℃进行醇解反应2-40h(优选30-60℃反应10-15h)，反应完全后，将反应液分离纯化，获得脂肪酸乙酯；所述红花油与乙醇体积比为1:0.1-1(优选1:0.5)，所述红花油与有机溶剂体积比为1:0.5-2(优选1：1.25)，所述脂肪酶添加量以红花油、乙醇和有机溶剂总体积计为5-50g/l(优选10-20g/l)。
进一步，所述脂肪酶形式可以为微生物发酵所得湿菌体干燥得到的静息细胞、经分离纯化后的脂肪酶提取物或者其固定化酶形式。优选所述脂肪酶固定化脂肪酶，更优选所述固定化脂肪酶为下列之一：南极假丝酵母脂肪酶b(candidaantarcticalipaseb，优选novozym435)、疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(thermomyceslanuginosuslipase，优选lipozymetlim)、米赫根毛霉脂肪酶(rhizomucormieheilipase，优选lipozymermim)、洋葱假单胞菌脂肪酶(pseudomonascepacialipase，优选lipasepsim)。其中丹麦诺维信公司novozym435为固定化南极假丝酵母脂肪酶b是一种商品化脂肪酶，原料易得，催化效率高，稳定性好，具有较宽的底物范围。
进一步，优选所述有机溶剂为下列之一：叔丁醇、正己烷、环己烷、石油醚、甲苯、苯、乙醚或氯仿，更优选叔丁醇和正己烷。
进一步，所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液过滤除去脂肪酶，滤液通过蒸馏除去有机溶剂得到产物脂肪酸乙酯和甘油，再分层分别获得脂肪酸乙酯和甘油。
本发明所述红花油购至中粮天海粮油工业(沙湾)有限公司，产品酸值(mgkoh/g)0.4，碘值(gi/100g)142，过氧化值(mmol/kg)3.0，脂肪酸组成(棕榈酸5.86％，硬脂酸2.15％，油酸10.7％，亚油酸78.8％)。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明酶催化反应条件温和，反应产率高(由90％提高95％以上)，下游分离简单(化学法需要加酸中和碱性催化剂)，能耗低(化学法温度高)，环境污染小(生物法废水减少80％以上)，适合工业化生产。
(四)附图说明
图1酶产物脂肪酸乙酯的gc-ms质谱丰度图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
在密闭10ml三角瓶中，将0.8ml红花油和0.4ml无水乙醇溶于0.8ml叔丁醇，加入0.010g固定化脂肪酶novozyme435，在40℃恒温振荡反应12小时，振荡速度为200r/min，取样进行气相色谱分析，发现脂肪酸乙酯转化率为90.6％。反应结束后，将反应液过滤除去固定化脂肪酶，滤液通过蒸馏除去有机溶剂得到产物脂肪酸乙酯和甘油，再静置分层分别获得脂肪酸乙酯和甘油，脂肪酸乙酯产率90.2％，甘油产率85.2％。
脂肪酸乙酯的气相色谱仪测定条件：db-23毛细管柱；检测条件为柱温220℃，恒温保持10min，进样温度250℃，检测器温度250℃，载气为高纯氮气，柱头压107.27kpa；尾吹气流量24.0ml·min-1；分流比20:1。
实施例2
在密闭10ml三角瓶中，将0.8ml红花油和0.4ml无水乙醇溶于0.8ml叔丁醇，加入不同质量的固定化脂肪酶novozyme435(脂肪酶用量以红花油、乙醇和叔丁醇总体积计，见表1所示)，在40℃恒温振荡反应12小时，振荡速度为200r/min，取样进行气相色谱分析，发现脂肪酸乙酯转化率如表1所示。
表1：不同酶添加量的酶转化结果
实施例3
在密闭10ml三角瓶中，将0.8ml红花油和0.4ml无水乙醇溶于0.8ml叔丁醇，加入0.2g固定化脂肪酶novozyme435，在不同温度下恒温振荡反应12小时，振荡速度为200r/min，取样进行气相色谱分析，发现脂肪酸乙酯转化率如表2所示，其中45℃转化率最高。
表2：不同温度条件的酶转化结果
实施例4：
按实施例3方法，45℃条件下用其它有机溶剂代替叔丁醇作为反应介质，其他条件不变，利用固定化脂肪酶novozyme435对红花油进行酶法乙醇解。该反应的转化率见表3。表3结果表明，在反应转化率方面，叔丁醇和正己烷作为反应介质都要优于其他溶剂。
表3：不同溶剂体系的酶转化结果
实施例5：
按实施例3方法，45℃条件下用不同脂肪酶作为催化剂其他条件不变，叔丁醇为溶剂，脂肪酶对红花油进行酶法乙醇解。该反应的转化率见表4。表4结果表明，novozyme435要优于其他脂肪酶。
表4：不同脂肪酶的酶转化结果
实施例6：
按实施例3方法，45℃条件下0.8ml红花油与不同体积乙醇，其他条件不变，叔丁醇为溶剂，novozyme435对红花油进行酶法乙醇解。该反应的转化率见表5。表5结果表明，0.4ml乙醇添加量较优。
表5：不同体积乙醇的酶转化结果
实施例7：
按实施例3方法，45℃条件下不同叔丁醇添加量，其他条件不变，novozyme435对红花油进行酶法乙醇解。转化率见表6，随叔丁醇体积增加，转化率有一定的提高，其中1.6ml叔丁醇转化率最高。
表6：不同体积叔丁醇的酶转化结果
实施例8
在密闭10ml三角瓶中，将0.8ml红花油和0.4ml无水乙醇溶于0.8ml叔丁醇，加入0.2g固定化脂肪酶novozyme435，在45℃恒温振荡反应12小时，振荡速度为200r/min，过滤出固定化脂肪酶后，将反应液在0.1mpa压力下减压蒸馏至无馏出物，再静置分层除去甘油，获得脂肪酸乙酯和未反应的甘油酯。将脂肪酸乙酯和未反应的甘油酯再加入0.4ml无水乙醇，1ml叔丁醇，0.5g固定化脂肪酶novozyme435，在45℃恒温振荡继续反应12小时，振荡速度为200r/min，取样进行气相色谱分析，发现脂肪酸乙酯转化率为99.0％，脂肪酸乙酯产率98.5％，甘油产率95.2％。
实施例9：
按实施例3方法制得的酶催化反应液，45℃下脂肪酸乙酯转化率为93.6％。反应结束，将反应液过滤，滤液在0.1mpa压力下减压蒸馏至无馏出物，再静置分层获得脂肪酸乙酯和未反应的甘油酯，纯度为98.5％，脂肪酸乙酯产率94.5％，甘油产率92.2％。脂肪酸乙酯和未反应的甘油酯通过精馏方法(240℃，30pa)分离，脂肪酸乙酯纯度为99.5％。经gc-ms分析酶解产物脂肪酸乙酯中各种脂肪酸含量(见图1)，结果见表7。
脂肪酸乙酯的gc-ms分析条件：气相色谱柱型号hp-5ms，进样口温度250℃；进样量1μl；分流比100:1；柱流速1ml/min；柱温箱温度：100℃保持2min，10℃/min升温至250℃保留8min；辅助加热区温度250℃；ms四极杆温度150℃，离子源温度230℃。el+轰击源，全扫描模式扫描，扫描质量范围：30～500amu，发射电流：200μa，电子能量：70ev。
表7：酶产物脂肪酸乙酯的相对含量
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。