一种BRCA1/2基因变异联合检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于基因变异检测
技术领域：
，具体涉及brca1/2基因变异联合检测试剂盒及其应用。
背景技术：
：1990年，研究者发现了一种与遗传性乳腺癌密切相关的基因，命名为乳腺癌1号基因(brca1)，定位于第17号染色体；4年之后，研究者在第13号染色体上又发现了另外一种与乳腺癌有关的基因，称为brca2，通常将两种基因统称为brca1/2。brca是抑癌基因，在调节细胞复制、dna损伤修复、细胞正常生长方面有重要作用；如果brca基因突变，就丧失了抑制肿瘤发生的功能。brca突变类型达数百种之多，与人体的很多癌症的发生都有关系，其中关系最密切者是乳腺癌，其次是卵巢癌。乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率高居女性肿瘤首位，全世界每年约50万妇女死于乳腺癌。乳腺癌是多因素、多基因和环境共同作用的结果，其家族遗传性早已被人们所认识。研究发现5％～10％的乳腺癌患者具有家族聚集性和遗传倾向性。大量研究表明，具有胚系brca1突变的家族表现出较高的乳腺癌易感性：这种女性终身患有乳腺癌的风险率是80％～90％，而且患者的发病年龄明显降低。brca2基因突变的携带者患乳腺癌的危险性与brca1突变者相似，也为80％～90％。据推算，在3亿多美国人中，约有25-50万为brca1/2基因突变携带者。一般人群中brca基因突变携带率为1/400-600，而在某些特定族群中brca突变携带率高达1/40-50，如德系犹太人，冰岛人和法裔加拿大人。中国人群中brca1/2基因突变携带情况尚不清楚，一般认为低于美国和北欧国家。根据bic数据库(breastcancerinformationcore,http://research.nhgri.nih.gov/bic/)，brca1和brca2基因目前已报道的变异类型包括无义突变、移码突变、非移码插入、非移码缺失、错义突变、同义突变、剪接位点突变以及大片段的缺失或重排等，涉及到近4000个变异位点，而且这些突变分散遍布于各个外显子，没有证据表明存在突变热点区域，只存在少数几个相对高频的变异位点。虽然brca1/2基因有变异并不能判断患有乳腺癌，进行乳腺癌brca基因的检测，可以提示个体患乳腺癌和卵巢癌的风险，对自身的身体状况提早了解。对高风险个体进行针对性的专业预防，比如服用一些针对性的药物进行干预，预防性的剥离/摘除手术等。对确诊的癌症进行精准治疗。目前检测brca1/2基因突变的方法主要有sanger测序、qpcr方法或mlpa，但这些方法的测序通量低，灵敏度不高，且需要耗费大量的时间并且价格不菲。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供brca1/2基因变异联合检测试剂盒，可同时检测血液样本中胚系brca1和brca2基因的不同的突变位点，同时具有检测灵敏度高，重复性好的特点。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种brca1/2基因变异联合检测试剂盒，包括以下试剂：brca1基因引物组、brca2基因引物组、聚合酶、pcr反应液、消化酶、连接酶、连接酶缓冲液、连接接头、荧光探针、qpcr反应的taq酶、qpcr引物和qpcr反应液；所述brca1基因引物组包括52对引物，brca1基因引物的核酸序列如seqidno1～seqidno104所示；所述brca2基因引物组包括84对引物；brca2基因引物的核酸序列如seqidno105～seqidno272所示。优选的，qpcr引物的核苷酸序列如seqidno273～seqidno274所示。优选的，荧光探针的核苷酸序列如seqidno275所示。优选的，连接接头的核苷酸序列如seqidno276～seqidno286所示。优选的，消化酶为磷酸二酯酶；所述磷酸二酯酶的酶活力为2u/μl～8u/μl。优选的，连接酶为t4连接酶；所述t4连接酶的酶活力为0.5u/μl～2u/μl。优选的，所述pcr反应液和qpcr反应液包含下列含量的组分：包含摩尔浓度为10mmol/l的dntp混合物的5×扩增酶反应液；所述5×扩增酶反应液包含摩尔浓度为25mmol/l～75mmol/ltris-hcl、25mmol/l～75mmol/lkcl、5mmol/l～10mmol/lmg2+和质量浓度为25％～70％的甘油。优选的，聚合酶的酶活力为2.5u/μl～7u/μl。优选的，连接酶缓冲液包含下列含量的组分：包含摩尔浓度为10mmol/l的dntp混合物的5×扩增酶反应液；所述5×扩增酶反应液包含摩尔浓度为25mmol/l～75mmol/ltris-hcl、25mmol/l～75mmol/lmg2+、2.5mmol/l～7.5mmol/latp、2.5mmol/l～7.5mmol/ldtt和质量浓度为15％～35％的聚乙二醇。本发明还提供了所述的试剂盒在检测brca1和/或brca2基因突变中的应用。本发明提供了一种brca1/2基因变异联合检测试剂盒，包括以下试剂：brca1基因引物组、brca2基因引物组、聚合酶、pcr反应液、消化酶、连接酶、连接酶缓冲液、连接接头、荧光探针、qpcr反应的taq酶、qpcr引物和qpcr反应液；所述brca1基因引物组包括52对引物，brca1基因引物的核酸序列如seqidno1～seqidno104所示；所述brca2基因引物组包括84对引物；brca2基因引物的核酸序列如seqidno105～seqidno273所示。本发明提供的联合检测试剂盒能同时检测乳腺癌的两种驱动基因的突变位点，包括brca1和brca2基因的多个突变位点，使实验结果灵敏度高，可以检测出5％以下的突变率，大大提高了检测灵敏度，克服了现有技术中的难题。同时，本发明提供的试剂盒通过连接接头的应用，使得一次检测可以同时检测几十个甚至几百个样本，使整个实验过程简单，快速，成本低；另外所述试剂盒对每个样本的需求量低，每个样本只需要10～100ngdna即可。本发明提供的试剂盒对驱动性突变基因的检测提供了有效手段。附图说明图1为本发明中文库构建流程图；图2为实施例1中iontorrentproton测序结果。具体实施方式本发明提供了本发明提供了brca1/2基因变异联合检测试剂盒，包括以下部分：brca1基因引物组、brca2基因引物组、聚合酶、pcr反应液、消化酶、连接酶、连接酶缓冲液、连接接头、荧光探针、qpcr反应的taq酶、qpcr引物和qpcr反应液；所述brca1基因引物组包括52对引物，所述brca1基因引物的核酸序列如seqidno1～seqidno104所示；所述brca2基因引物组包括84对引物；所述brca2基因引物的核酸序列如seqidno105～seqidno272所示。所述各基因引物组的正向序列和反向序列的来源委托thermofisher公司合成。所述引物的摩尔浓度优选为2～10μmol/l，更优选为5μmol/l。所述的引物的体积优选为5～20μl，更优选为10μl。本发明中，qpcr正反向引物的核苷酸序列优选如seqidno273～seqidno274所示。所述qpcr正向引物和反向引物的来源委托核苷酸合成公司合成。所述正向引物或反向引物的摩尔浓度优选为5～20μmol/l，更优选为10μmol/l。所述正向引物或反向引物的体积优选为5～20μl，更优选为10μl。本发明中，荧光探针的核苷酸序列优选如seqidno275所示。所述dna探针的摩尔浓度优选为2.5～10μmol/l，更优选为5μmol/l。所述dna探针的体积优选为2.5～10μl，更优选为5μl。所述荧光探针的来源委托thermofisher公司合成。本发明中，所述连接接头的核苷酸序列优选如seqidno276～seqidno286所示。每种连接接头对应一个待测样本，从而通过不同的连接接头来区分不同样本的检测结果。所述连接接头的摩尔浓度优选为5～20μmol/l，更优选为10μmol/l。所述连接接头的体积优选为2～20μl，更优选为10μl。本发明中，所述消化酶优选为磷酸二酯酶；所述磷酸二酯酶的酶活力优选为2u/μl～8u/μl，更优选为5u/μl。本发明对所述磷酸二酯酶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的磷酸二酯酶的来源即可。本发明实施例中，所述磷酸二酯酶购自sigma公司。本发明中，所述连接酶为t4连接酶；所述t4连接酶的酶活力优选为0.5u/μl～2u/μl，更优选为1u/μl。本发明对所述连接酶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的连接酶的来源即可。本发明实施例中，所述连接酶购自thermofisher。本发明中，所述pcr反应液优选包含下列含量的组分：10mm的dntp混合物的5×扩增酶反应液；所述5×扩增酶反应液包括以下含量组分：25mmol/l～75mmol/ltris-hcl、25mmol/l～75mmol/lkcl、5mmol/l～10mmol/lmg2+和质量浓度为25％～70％的甘油；更优选为：所述pcr反应液的体积优选为10～100μl，更优选为50μl。本发明中，所述qpcr反应液优选包含下列含量的组分：10mmol/l的dntp混合物的5×扩增酶反应液；所述5×扩增酶反应液包括以下含量组分：25mmol/l～75mmol/ltris-hcl、25mmol/l～75mmol/lkcl、5mmol/l～10mmol/lmg2+和质量浓度为25％～70％的甘油；更优选为：成分浓度tris-hcl(ph8.2)50mmol/lkcl50mmol/lmgcl28mmol/l甘油50％所述qpcr反应液的体积优选为10～100μl，更优选为25μl。本发明中，所述qpcr反应的taq酶的来源购自thermofisher公司。本发明中，所述聚合酶的酶活力优选为5u/μl。所述聚合酶的体积优选为10μl。本发明对所述聚合酶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的聚合酶的来源即可。本发明实施例中，所述聚合酶购自thermofisher。本发明中，所述连接酶缓冲液的主要成分为：25mmol/l～75mmol/ltris-hcl、25mmol/l～75mmol/lmg2+、2.5mmol/l～7.5mmol/latp、2.5mmol/l～7.5mmol/l二硫苏糖醇(dtt)和质量浓度为15％～35％的聚乙二醇；更优选为：成分浓度tris-hcl(ph7.6)50mmol/lmgcl250mmol/latp5mmol/ldtt5mmol/l聚乙二醇25％(w/v)本发明还提供了所述的试剂盒在检测brca1和/或brca2基因突变中的应用。本发明中，所述试剂盒的检测方法优选包括以下步骤：(1)使用上述技术方案所述试剂盒中所述brca1引物组或brca2引物组对待测样本的dna进行扩增，得到pcr扩增产物；(2)将所述步骤(1)得到的pcr扩增产物与消化酶混合，对目的片段两端的引物进行剪切处理，得到平末端dna片段；(3)将所述步骤(2)得到的平末端dna片段与连接接头、连接酶和连接酶缓冲液混合，连接，得到连接有接头的dna片段；(4)用磁珠纯化试剂盒按照操作说明对所述步骤(3)得到的dna片段进行纯化，得到检测文库；(5)用荧光定量pcr法对所述步骤(4)中得到的检测文库进行定量检测；(6)将不同样本制备的定量后的文库进行混合，连接离子球微粒后，将连接有离子球微粒的文库在ot2仪器上进行油包水pcr，得到的模板进行测序，得到测序结果；(7)将筛选后的步骤(6)中得到的测序结果与人类基因库hg19数据库进行序列比对，获得突变位点，结合生物信息学分析软件对突变位点进行注释，从而确定突变基因。本发明使用上述技术方案所述试剂盒中所述引物组对待测样本的dna进行pcr扩增。本发明中，所述pcr扩增的扩增体系如下：本发明中，所述pcr扩增的扩增程序如下：pcr扩增结束后将同一模板dna样本的两组扩增产物混合。本发明中，得到pcr扩增产物后优选进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增情况。所述琼脂糖凝胶电泳的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的琼脂糖凝胶电泳方案即可。得到pcr产物后，本发明向pcr产物中加入消化酶，对目的片段两端的引物进行剪切处理，得到平末端dna片段。本发明中，所述消化酶的加入体积量优选为pcr产物的体积的0.08～0.15倍，更优选为0.1倍。本发明中，所述消化的程序如下：温度时间50℃10min55℃15min60℃20min得到平末端dna片段后，本发明将所述平末端dna片段、连接接头、连接酶和连接酶缓冲液混合，连接，得到连接有接头的dna片段。本发明中，所述平末端dna片段、连接接头、连接酶和连接酶缓冲液混合量的比例如下：组分体积5×连接酶缓冲液4μl连接酶(ligase)2μl连接接头(100pmol/l)2μl消化产物22μl总体积30μl所述连接的方法没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的连接方案即可。本发明中所述连接优选采用pcr仪中进行反应。所述连接的程序如下：得到连接有接头的dna片段后，本发明用磁珠纯化试剂盒按照操作说明对所述dna片段进行纯化，得到检测文库。本发明中，所述磁珠纯化试剂盒购于贝克曼公司。得到检测文库后，本发明用荧光定量pcr法对所述检测文库进行定量检测。本发明中，所述荧光定量pcr的反应体积如下：组分体积qpcr的taq酶1μl5×qpcr缓冲液5μlqpcr引物(100pmol/l)2μl荧光探针(100pmol/l)2μl模板4μlddh2o补至20μl本发明中，所述荧光定量pcr的反应程序如下：得到定量后的文库后，本发明将不同样本制备的定量后的文库进行混合，连接离子球微粒后，将连接有离子球微粒的文库在ot2仪器上进行油包水pcr，得到的模板进行测序，得到测序结果。本发明中，根据qpcr结果得到文库的浓度，将制备好的文库稀释成100pm的浓度，将不同样本的文库等体积混合后在配套的仪器iononetouch2和es仪器上面进行油包水pcr，富集pcr产物。本发明中，所述油包水pcr优选使用thermofisher公司生产的iononetouch200templatekitv2试剂盒。得到测序结果后，本发明将筛选后的测序结果与人类基因库hg19数据库进行序列比对，获得突变位点，结合生物信息学分析软件对突变位点进行注释，从而确定突变基因。本发明中，所述筛选的方法为使用iontorrentproton仪器自带的默认的质控参数去除多克隆的数据和低质量的数据。本发明中，所述比对优选采用iontorrentproton仪器自带的服务器将筛选后的序列数据与人类基因库hg19数据库进行序列比对，从而得到突变位点。本发明中，根据测序后获得测序深度数据500以上和覆盖度数据达到90％以上时，证明测序的质量可信度高，得到的比对后得到的碱基变异情况。本发明中，所述测序深度每个样本都在3万以上，测序reads的覆盖度都在90％以上。本发明中，检测的突变位点结合生物信息学分析软件对突变位点进行注释。所述注释的方法优选为参考比对的数据库进行。所述参考比对的数据库优选为clinvar数据库以及refseq数据库。下面结合实施例对本发明提供的brca1/2基因变异联合检测试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1取horizonbrcasomaticmultiplexreferencestandard进行多基因驱动突变的联合检测。1、按照本发明所述试剂盒和方法稀释gdna，用qubitdsdnahsassaykit定量试剂盒对稀释后的gdna进行精确定量，使dna浓度约3ng/ul。a、目标dna扩增；按下述组分，配制pcr体系，进行目的片段扩增。按下述扩增条件，进行pcr扩增：pcr扩增结束后将同一模板dna样本的两组扩增产物混合。b、引物序列的部分消化：在扩增产物中，加入2μl消化酶，按下列条件进行消化反应。可在pcr仪中进行。温度时间50℃10min55℃15min60℃20minc、接头连接：在消化完成的体系中加入接头序列和连接酶体系。体系如下：组分体积5×连接酶缓冲液4μl连接酶(ligase)2μl连接接头(100pmol/l)2μl消化产物22μl总体积30μl反应条件如下，可在pcr仪中进行反应：温度时间22℃30min68℃2min72℃5mind、cdna纯化：用本发明的磁珠(购于贝克曼公司)进行dna的纯化。用磁珠吸附目标dna片段，在磁力架上，用75％酒精进行洗涤dna1次，然后用试剂盒中配好的tris-edta溶液进行洗脱，得到的纯化好的就是我们需要的文库。e、文库定量：将上述步骤得到的文库进行荧光定量pcr定量。用参考品做对照，做标准曲线，将每个文库稀释100倍，按照下列的体系配置反应液：组分体积qpcr的taq酶1μl5×qpcr缓冲液5μlqpcr引物(100pmol/l)2μl荧光探针(100pmol/l)2μl模板4μlddh2o补至20μl按照下列反应程序进行qpcr：按照结果，将文库稀释至100pm浓度，各文库等体积混合，至此，文库制备完成。2、在iononetouch2实验平台上，用iononetouch200templatekitv2试剂盒进行油包水pcr，并富集pcr产物。操作按照仪器使用说明书进行。3、富集后的pcr产物可根据ionproton200sequencingkit说明进行样品处理，上样到测序仪配套的p1芯片，iontorrentproton进行高通量测序。4、结果分析。测序结果经过筛选，仪器自带的程序的默认质控环节将去除多克隆的数据和低质量的数据。iontorrent平台自带的服务器将得到的数据再与人类基因库hg19数据库进行序列比对(如图2)，符合率达到95％。获得测序深度数据图(如表1所示)和覆盖度数据图(如表1所示)，以及碱基变异情况(如表2所示)，测序深度每个样本都在3万以上，测序reads的覆盖度都在90％以上。检测到的突变，结合生物信息学分析软件对突变位点进行注释，注释主要比对的数据库为clinvar数据库以及refseq数据库。表1实施例1中待测样本的测序深度数据和覆盖度数据结果样本检测到的重复子数量平均测序深度覆盖度标准品2,000,8518,18698.31％基因突变联合检测结果见表2。表2本发明中碱基变异情况染色体位置基因名称氨基酸突变ref(参考)突变1741223094brca1s1613gag1741244000brca1k1183rag1741245090brca1k820ega1741234451brca1r1443stopga1741246245brca1d435ygt1741244936brca1p871lct1332906480brca2n289hac1332929387brca2v2466act1332911463brca2n991dag1332913558brca2k1691fs/dela1332913836brca2n1784fs/dela1332912750brca2d1420ygt1332937354brca2i2675fs/insa由表2可以看出，一次测序实验中，可以同时检测不同的基因突变包括brca1和brca2两种基因的多个突变位点，操作流程简单，耗时短。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。sequencelisting<110>上海鼎晶生物医药科技股份有限公司<120>一种brca1/2基因变异联合检测试剂盒及其应用<130>2017<160>286<170>patentinversion3.3<210>1<211>27<212>dna<213>人工序列<400>1ccagaaccaccatctttcagtaatttg27<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2cttgtttacagcgatgccaaca22<210>3<211>30<212>dna<213>人工序列<400>3gtgaaagtatctagcactgtgtatgtatgt30<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列<400>4acttccattgaaggaagcttctctt25<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列<400>5ggcagagaagacttctgaggcta23<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<400>6cttcatccggagagtgtagggta23<210>7<211>29<212>dna<213>人工序列<400>7cttctataaagttaggtgtttcctgggtt29<210>8<211>30<212>dna<213>人工序列<400>8tcagtcataacagctcaaagttgaacttat30<210>9<211>26<212>dna<213>人工序列<400>9ttgtgcaaacttcctgagttttcatg26<210>10<211>30<212>dna<213>人工序列<400>10ggttttctactgttgctgcatcttattttt30<210>11<211>27<212>dna<213>人工序列<400>11aggtcccaaatggtcttcagaataatc27<210>12<211>30<212>dna<213>人工序列<400>12gctttctgtaatcgaaagagctaaaatgtt30<210>13<211>29<212>dna<213>人工序列<400>13aaaatcaaagtgtttgttccaatacagca29<210>14<211>23<212>dna<213>人工序列<400>14caattggtggcgatggttttctc23<210>15<211>27<212>dna<213>人工序列<400>15agatgatgtcagcaaacctaagaatgt27<210>16<211>22<212>dna<213>人工序列<400>16ccagtcctgccaatgagaagaa22<210>17<211>23<212>dna<213>人工序列<400>17gtaactcagactcagcatcagca23<210>18<211>27<212>dna<213>人工序列<400>18aaaactgaggctctttagcttcttagg27<210>19<211>29<212>dna<213>人工序列<400>19gcctaccacaaatacaaattatgaccaag29<210>20<211>24<212>dna<213>人工序列<400>20ttctcttcaggaggaaaagcacag24<210>21<211>22<212>dna<213>人工序列<400>21cccatctgtcagcttcggaaat22<210>22<211>30<212>dna<213>人工序列<400>22gggaattacagataaattaaaactgcgact30<210>23<211>28<212>dna<213>人工序列<400>23gagacttcaagcagaaaatctttaaggg28<210>24<211>23<212>dna<213>人工序列<400>24ggacagtgtagcactctaccagt23<210>25<211>27<212>dna<213>人工序列<400>25atttggagtaatgagtccagtttcgtt27<210>26<211>26<212>dna<213>人工序列<400>26agaagaggaatgtgcaacattctctg26<210>27<211>22<212>dna<213>人工序列<400>27ggaagcagggaagctcttcatc22<210>28<211>24<212>dna<213>人工序列<400>28tcatgcatctcaggtttgttctga24<210>29<211>33<212>dna<213>人工序列<400>29attaaattacacagaactgtgattgttttctag33<210>30<211>26<212>dna<213>人工序列<400>30gctcatactactgatactgctgggta26<210>31<211>28<212>dna<213>人工序列<400>31tccaatacctaagtttgaatccatgctt28<210>32<211>23<212>dna<213>人工序列<400>32caaaggcatctcaggaacatcac23<210>33<211>28<212>dna<213>人工序列<400>33tccaggaagactttgtttatagacctca28<210>34<211>30<212>dna<213>人工序列<400>34ctgaaagagaaatgggaaatgagaacattc30<210>35<211>29<212>dna<213>人工序列<400>35tggatacttaaagccttctgtgtcatttc29<210>36<211>28<212>dna<213>人工序列<400>36cccaaagatctcatgttaagtggagaaa28<210>37<211>28<212>dna<213>人工序列<400>37attcgagttccatattgcttatactgct28<210>38<211>30<212>dna<213>人工序列<400>38tcctgaggattttatcaagaaagcagattt30<210>39<211>29<212>dna<213>人工序列<400>39ccttcttccgataggttttcccaaatatt29<210>40<211>29<212>dna<213>人工序列<400>40agaaagttaatgagtggttttccagaagt29<210>41<211>22<212>dna<213>人工序列<400>41gctgggagtccgcctatcatta22<210>42<211>25<212>dna<213>人工序列<400>42gttctgtttcaaacttgcatgtgga25<210>43<211>25<212>dna<213>人工序列<400>43tgttccactccaacatttgagaact25<210>44<211>30<212>dna<213>人工序列<400>44gagcaagatgctgattcattatttatcagc30<210>45<211>23<212>dna<213>人工序列<400>45gggagactgaagcacagtgaaaa23<210>46<211>29<212>dna<213>人工序列<400>46tttcataaacccattatccaggactgttt29<210>47<211>27<212>dna<213>人工序列<400>47acttaccagatgggacactctaagatt27<210>48<211>29<212>dna<213>人工序列<400>48gacgttgtcattagttctttggtttgtat29<210>49<211>26<212>dna<213>人工序列<400>49catttgttaacttcagctctgggaaa26<210>50<211>30<212>dna<213>人工序列<400>50caaattgatagttgttctagcagtgaagag30<210>51<211>27<212>dna<213>人工序列<400>51cttcctggtgggatctgtcattttata27<210>52<211>32<212>dna<213>人工序列<400>52gaaactagaagagatttctaaaagtctgagat32<210>53<211>30<212>dna<213>人工序列<400>53agcctaatcttactagacatgtcttttctt30<210>54<211>30<212>dna<213>人工序列<400>54cgcgttgaagaagtacaaaatgtcattaat30<210>55<211>29<212>dna<213>人工序列<400>55tgatgaatggttttataggaacgctatgt29<210>56<211>30<212>dna<213>人工序列<400>56cagttgtgagattatcttttcatggctatt30<210>57<211>23<212>dna<213>人工序列<400>57cttctccctgctcacactttctt23<210>58<211>30<212>dna<213>人工序列<400>58cgttgtgtaaattaaacttctcccattcct30<210>59<211>22<212>dna<213>人工序列<400>59cccatcgtgggatcttgcttat22<210>60<211>30<212>dna<213>人工序列<400>60aaagctcttcctttttgaaagtctgttttt30<210>61<211>30<212>dna<213>人工序列<400>61aaataaagatgtcagataccacagcatctt30<210>62<211>30<212>dna<213>人工序列<400>62cctgaattatcactatcagaacaaagcagt30<210>63<211>22<212>dna<213>人工序列<400>63gcctcgcctcatgtggttttat22<210>64<211>28<212>dna<213>人工序列<400>64taactagtattctgagctgtgtgctaga28<210>65<211>30<212>dna<213>人工序列<400>65gggaaggaaagaattttgcttaagatatca30<210>66<211>29<212>dna<213>人工序列<400>66ctcaaagtatttcattttcttggtgccat29<210>67<211>30<212>dna<213>人工序列<400>67aaatatttaaaatgtgccaagaactgtgct30<210>68<211>29<212>dna<213>人工序列<400>68aaaaatgatgaagtgacagttccagtagt29<210>69<211>30<212>dna<213>人工序列<400>69atcatggaaaatttgtgcattgttaaggaa30<210>70<211>24<212>dna<213>人工序列<400>70cctctcctctgtcattcttcctgt24<210>71<211>30<212>dna<213>人工序列<400>71ataggaaaataccagcttcatagacaaagg30<210>72<211>30<212>dna<213>人工序列<400>72gccacagtagatgctcagtaaatatttcta30<210>73<211>30<2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