一种特异靶向猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列及应用的制作方法

本发明涉及一种sgrna导向序列及应用。
背景技术：
：crispr/cas9基因编辑系统是基于ii类crispr/cas系统改造而来的。cas9蛋白是唯一所需要的，用来介导外源dna沉默的cas蛋白。2012年，jinek通过体外实验证实cas9蛋白对原间隔序列进行切割不仅仅需要与原间隔序列互补的成熟的crrna，还需要tracrrna；通过对切割后的片段测序发现，tracrrna：crrna指导cas9蛋白切割位点是具有位点特异性的，无论是环状质粒还是线性dna片段，切割位点均在pam序列上游的3bp处；cas9蛋白包含hnh及ruvc内切酶结构域，无论对哪个结构域进行突变，均无法有效的进行切割，只是在双链dna上产生切口，实验证实hnh结构域会对与crrna互补链进行切割，而ruvc结构域则会对另一条链进行切割；对于众多的crispr/cas系统，识别自我与非我的关键就在于保守的pam序列，对于ii类crispr/cas系统，pam序列为ngg，当对pam序列进行突变后，将无法进行有效的切割；此外，还成功的将crrna与tracrrna两条链成功的融合成一条大约100nt的单链向导rna(guiderna，grna)，并能正常发挥crrna：tracrrna的功能。这项工作为crispr/cas系统由细菌的天然防御系统向基因编辑工具的转变奠定了基础。2013年1月，麻省理工学院以及哈佛医学院同时再science上首次发表了使用crispr/cas系统对哺乳动物细胞进行基因编辑。在麻省理工学院的研究中，使用酿脓链球菌的ii类crispr/cas系统，针对人的emx1位点设计的crrna能够高效的在人的293ft细胞基因组的emx1位点上产生突变。针对该基因的不同pam序列设计crrna以及crrna与tracrrna嵌合在一起的chirna，对细胞进行基因编辑，crrna均能产生有效的突变，但可能由于rna的二级结构的影响，并不是所有的chirna都能进行高效的位点突变，此外，利用该系统对基因组进行切割后，不仅能够通过非同源性末端接合(nhej)的方式进行修复，获得在切割位点附近的碱基缺失或是插入，还可以通过同源重组修复(hdr)的方式，实现特异基因片段的重组，此外，通过针对同一基因的两个位点设计crrna，可以成功的进行一段片段的基因敲除。使用ruvc结构域突变的cas9蛋白也能够通过同源重组的修复方式进行修复，但无法获得非同源性末端接合的突变。哈佛医学院也获得了类似的结果，且crispr/cas9系统的基因编辑效率与先前出现的talen效率类似，并能够同时针对多个位点进行基因编辑。进一步证实了crispr/cas9系统终将成为真核生物基因编辑领域强大的基因编辑工具。insulinlikegrowthfactorbindingprotein3(igfbp3)基因属于生长激素超家族基因。主要作用是与igf1基因和igf2结合使igf1和igf2基因在体内能正常运输。igfbp3基因主要表达组织：早期胚胎，内胚层，间充质细胞，消化道系统，心血管系统，淋巴系统，肝胆系统，骨骼肌，神经系统，生殖系统，泌尿系统。igfbp3基因单敲除后小鼠表行没有变化，igfbp3基因双敲除后，主要表型为白色脂肪组织减少，体重增加，肝脏重增加，肌肉重量增加。同时，对高糖和高油脂食物出现耐受。这些表型的出现一般认为是igfbp3基因敲除后，igfbp2基因出现补偿效应，igfbp2基因的表达量升高，导致igf1基因在血液中含量增高，最终导致小鼠体重的增加。同时，基因敲除小鼠的采食量相比于正常小鼠没有发生显著性改变。在猪中研究表明，igfbp3基因与猪屠体重和背膘厚呈显著相关。技术实现要素：本发明目的在于提供一种特异靶向猪igfbp3基因的sgrna导向序列及其应用，该sgrna导向序列可以用于敲除猪igfbp3基因，为制备转基因猪奠定基础。本发明特异靶向猪igfbp3基因的sgrna导向序列为igfbp3-sgrna1，其核苷酸序列为：5’-cgtctcgcgcttggactcag-3’，如seqidno：1所示，位于基因igfbp3第二外显子。上述特异靶向猪igfbp3基因的sgrna导向序列在敲除猪igfbp3基因中的应用，具体方法如下：一、在猪igfbp3基因的sgrna导向序列的5’端加上cacc得到正向寡核苷酸；同时根据导向序列获得得其对应的dna互补链，并且再起5’端加上aaac得到反向寡核苷酸；分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性，退火，形成双链；二、将步骤一制得的双链dna与crispr/cas9载体连接，得到重组敲除表达载体；三、将步骤二制得的重组表达载体连接入药物筛选抗性基因序列；四、将步骤三制得的重组敲除表达载体转染细胞，筛选稳定转染细胞，得到成功敲除igfbp3基因的细胞。进一步的，步骤二中所述的crispr/cas9载体为px330载体。进一步的，步骤三中所述的药物筛选抗性基因序列为g418抗性基因序列。进一步的，步骤四中所述转染细胞的方法为脂质体转染法。进一步的，步骤四中所述的细胞为猪成纤维细胞。上述特异靶向猪igfbp3基因的sgrna导向序列在特异识别和靶向修饰猪igfbp3基因中的应用。上述特异靶向猪igfbp3基因的sgrna导向序列在构建猪igfbp3基因突变库中的应用。特异靶向猪igfbp3基因的sgrna导向序列，能产生基因插入突变、基因序列置换、基因序列缺失等多种类型igfbp3基因突变体，可以在构建猪igfbp3基因突变库中的应用。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明根据sgrna导向序列设计合成两条单链核苷酸序列，退火形成双链，然后与cas9载体连接，利用cas9载体将sgrna及crispr系统引入目标细胞中，cas9蛋白会在sgrna的引导下找到与其匹配的基因组dna序列，进行剪切，实现猪基因igfbp3的敲除。(1)利用质粒载体px330将sgrna以及crispr系统引入细胞中，cas9蛋白会在sgrna的引导下找到与其匹配的dna序列，进行剪切。质粒载体安全性高，不会引起细胞的免疫反应。(2)载体中含有g418抗性基因，利用g418对细胞进行筛选，未转入px330载体的细胞将在筛选过程中被淘汰。(3)本发明提供的特异靶向猪igfbp3基因的sgrna导向序列，可通过crispr/cas9系统敲除或编辑igfbp3基因，进而消除igfbp3的表达，为制备igfbp3转基因猪奠定基础。附图说明图1是特异靶向猪igfbp3基因的sgrna导向序列及其位置示意图。图2是pcr扩增猪igfbp3基因外显子2片段电泳图。具体实施方式下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。以下实施例中所使用的细胞为原代培养猪成纤维细胞，px330，pegfp-c1载体购自addgene，内切酶bbsi，bsmbi购自neb，g418和细胞培养基购自sigma。实施例1：(1)sgrna设计根据猪igfbp3基因的基因组序列(geneid：001005156)，设计1个靶向猪igfbp3基因的sgrna。20nt的寡核苷酸sgrna导向序列为：igfbp3-sgrna1:5’-cgtctcgcgcttggactcag-3’，位于基因igfbp3第二外显子；在其5’端加上cacc得到正向寡核苷酸序列；根据导向序列获得其对应的dna互补链，并且在其5’端加上aaac得到反向寡核苷酸。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的正向和反向sgrna寡核苷酸序列：95℃变性5min，72℃退火10min；退火后可以形成带有粘性末端的双链dna，具体寡核苷酸序列见表1。表1sgrna导向序列的寡核苷酸序列核苷酸序列(5’至3’)sg1-fcacccgtctcgcgcttggactcagsg1-raaacctgagtccaagcgcgagacg(2)构建表达sgrna的载体质粒载体px330有bbsi酶切位点，用bbsi酶切，其中，酶切体系为10μl体系：bbsi1μl；10×nebuffer1μl；质粒2μl；ddh2o6μl；酶切条件为：37℃酶切过夜；将酶切后载体px330与步骤(1)制得的退火双链利用t4连接酶进行连接，连接体系为10μl体系：px330载体2μl，退火双链sgrna6μl，10nebt4dnaligasebuffer1μl，t4ligase1μl；连接条件为16℃连接过夜；将连接产物转化感受态细菌dh5α，具体转化方法为：-80℃取出感受态细菌dh5α，在冰浴溶解；然后100μl感受态细菌中加入10μl的上述连接产物，混匀后冰浴30min；42℃水浴100s热激活，冰浴2min；然后加入900μlsoc培养基，37℃摇床60min；涂amp+(100μg/ml)固体soc培养基平板，37℃培养过夜，挑取阳性克隆，在soc液体培养基中37℃摇床过夜，之后用tiangen质粒抽提试剂盒提取质粒并测序验证，得到表达sgrna的px330-igfbp3-sg1质粒载体。实施例2：(1)g418抗性基因的获得根据质粒pegfp-c1载体中g418抗性基因设计引物，引物寡核苷酸序列5’端加入bsmbi酶切位点，kana-f：5-ggcgtctccgggatgtgcgcggaacccctatttg-3，kana-r：5-ggcgtctcgcgcgcaatctaaagtatatatgagtaacc-3，分别合成上下游引物序列，以质粒pegfp-c1为模板进行pcr扩增，pcr反应体系为50μl体系：pegfp-c1质粒1μl，2×pcrmix25μl，上下游引物各1μl，ddh2o22μl。pcr反应条件为：94℃5min，94℃30s，60℃45s，72℃1min40s，共33个循环，之后72℃延伸10min。获得的dna片段命名为kana。表2扩增kana片段的引物序列序列(5’至3’)kana-fggcgtctccgggatgtgcgcggaacccctatttgkana-rggcgtctcgcgcgcaatctaaagtatatatgagtaacc(2)构建含有g418抗性基因的载体质粒将px330-igfbp3-sg1质粒载体和kana片段dna分别用bsmbi酶切，酶切体系为20μl体系：bbsi1μl；10×nebuffer2μl；质粒或dna片段4μl；ddh2o13μl；酶切条件为：37℃酶切过夜；将酶切后的px330-igfbp3-sg1质粒载体和kana片段利用t4连接酶进行连接，连接步骤同实施例1中步骤(2)，连接产物转化感受态细菌dh5α，转化步骤同实施例1中步骤(2)，得到连接g418抗性基因的px330-g418-igfbp3-sg1质粒载体。实施例3：(1)猪成纤维细胞的培养猪胎儿成纤维细胞分离培养方法参见文献：信吉阁；成文敏；潘伟荣；卿玉波；查星琴；富国文；魏红江；曾养志。猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞培养方法的研究，黑龙江畜牧兽医，2013(9)：175-179.(2)质粒转染和阳性细胞筛选将重组质粒px330-g418-igfbp3-sg1通过脂质体转染的方法转染猪胎儿成纤维细胞，得到重组细胞。转染的具体步骤参见脂质体3000(invitrogen，货号：11668019)操作说明书方法进行转染。将转染后细胞利用1000ng/ml的g418对转染后的细胞进行筛选，筛选持续10d，对筛选后的细胞进行培养并冷冻保存。(3)基因敲除效果鉴定根据所设计的sgrna序列设计鉴定引物，用于对敲除后目的片段进行鉴定，所设计的引物如表3所示：表3扩增igfbp3片段的引物序列序列(5’至3’)e2-fgtcgttaaatgccaatgaccctce2-raggtgcaccccaccccaccat利用takara公司takaraminibestuniversalgenomicdnaextractionkitver.5.0，codeno.9765.对稳定转染的细胞进行基因组抽提，利用鉴定引物进行pcr鉴定。其pcr反应体系为50μl体系：基因组dna1μl，2×pcrmix25μl，上下游引物各1μl，ddh2o22μl。pcr反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环，之后72℃延伸10min。获得的dna片段命名为igfbp3-e2。pcr反应产物琼脂糖凝胶电泳后，利用gelextractionkit(takara)进行胶回收，对胶回收产物进行测序分析，测序结果如图2所示。测序结果表明细胞基因组在基因编辑处发生了突变，对照组与野生型基因组进行了对比没有发生变化。本发明成功建立了敲除igfbp3基因的猪成纤维细胞。序列表<110>东北农业大学<120>一种特异靶向猪igfbp3基因的sgrna导向序列及应用<160>7<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>导向序列igfbp3-sgrna1<400>1cgtctcgcgcttggactcag20<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸序列sg1-f<400>2cacccgtctcgcgcttggactcag24<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>寡核苷酸序列sg1-r<400>3aaacctgagtccaagcgcgagacg24<210>4<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223>序列kana-f<400>4ggcgtctccgggatgtgcgcggaacccctatttg34<210>5<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223>序列kana-r<400>5ggcgtctcgcgcgcaatctaaagtatatatgagtaacc38<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列e2-f<400>6gtcgttaaatgccaatgaccctc23<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物序列e2-r<400>7aggtgcaccccaccccaccat21当前第1页12