【
技术领域：
】本发明属于荧光定量pcr扩增检测的dna聚合酶
技术领域：
，特别是涉及一种双热启动dna聚合酶及pcr扩增检测方法。
背景技术：
：dna聚合酶进行pcr反应时，由低温(20℃～37℃)升至高温(94℃～95℃)的过程中，仍然具有残留的酶活性，低水平的非特异性退火和延伸在反应开始和热循环期间发生，这反过来又导致了随后的pcr循环中的非特异性扩增产物的形成，最终通过降低所需扩增信号或信号被高背景值掩盖而使反应的灵敏度和产量降低。热启动pcr是在起始变性阶段后开始pcr酶促反应，通过热启动降低引物二聚体的形成、引物错配和非特异性扩增，从而增加pcr的特异性和敏感性，提高pcr产量。自从热启动作为在较低温度下阻断dna聚合酶延伸的一种手段以来，针对反应的基本成分如mg2+、dna聚合酶、引物和dntp，也开发了许多方法。①通过石蜡法和低熔点琼脂糖包埋法将taqdna聚合酶包裹，与其它pcr反应组分分离，直到温度升高到一定温度(65℃～70℃)，taq聚合酶被释放而发挥作用。这种方法虽然简便，但耗时，而且可能会引入污染。②使用针对taq聚合酶的单克隆抗体，常温下，单克隆抗体结合到taq酶活性位点，酶的活性受到抑制，当温度达到70℃后，抗体失活，taq酶被释放。使用酶抗体针对性强，但是制备抗体周期长、成本高，而且在给定的温度下，抗体不一定能全部变性掉。③化学修饰的taqdna聚合酶，将聚合酶的活性中心封闭，在室温下阻断taq聚合酶活性，而聚合酶活性在第一个pcr预变性步骤中恢复。这种方法没有动物源dna的污染。利用柠康酸酐修饰kt-c3dna聚合酶，封闭kt-c3dna聚合酶的酶活性，pcr过程中，只有当温度升至95℃后，酸酐才从聚合酶上解离，酶活性恢复，实现热启动。④修饰引物。一种使用两个双链引物取代正常单链引物的方法，每个双链引物包括两条相同长度的单链寡核苷酸引物，一条称为“引物链”，用来扩增；另一条称为“竞争链”，与“引物链”互补，含有一个或多个错配的核苷酸，在pcr反应中不能延伸。在低温条件下，“引物链”结合到“竞争链”上形成双链，只有在合适的扩增条件下，“竞争链”才会被模板取代，进行正常的扩增。“竞争链”的竞争作用增加了“引物链”结合dna模板的特异性。⑤修饰dntp，用醚和酯取代dntp上的2’-脱氧核糖核苷和3’-三磷酸基团，使dntp不能发挥作用，经高温(95℃)预热后，修饰过的dntp会转化成正常的dntp，参与pcr反应。⑥利用金纳米粒子(aunp)和量子点(qd)在低温下与pfudna聚合酶相互作用，抑制聚合酶活性，从而降低非特异性扩增，在高温下从酶上解离，使pcr反应按正常方式进行。总的来说，热启动pcr是减少或消除非特异扩增产物以及引物二聚体形成的有效方法，它能够应用于基因组dna单拷贝序列扩增、长片段pcr扩增和多重pcr扩增中。现有技术中，应用于pcr反应的热启动酶往往只有一种，要么是抗体封闭，要么是化学修饰。抗体封闭的热启动酶起效快，可在反应初期被完全激活，发挥最大活性，但后力不足；而化学修饰的热启动酶则比较慢热，在高温变性过程中缓慢释放活性，从而保证始终特异的扩增。中国专利申请号为第cn201510707423.1号揭露了一种含有染料evagreen和双热启动酶的定量pcr方法，该专利中双热启动酶包括：hotstartaqdna聚合酶和antitaqdna聚合酶，该antitaqdna聚合酶为普通单克隆抗体，单克隆抗体封闭的热启动taq聚合酶，虽然特异性强，但是其制备过程复杂、耗时长，价格比较昂贵。总体来说，上述的pcr扩增方法的稳定性、灵敏性仍然还是不高，因此，有必要提供一种新的双热启动dna聚合酶解决上述问题。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种含有纳米抗体的双热启动dna聚合酶及pcr扩增检测方法，以提高pcr扩增检测方法的稳定性、灵敏性。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种含有纳米抗体的双热启动dna聚合酶，由化学修饰热启动taq酶和纳米抗体封闭热启动taq酶按照浓度1:1比例混合而成。为实现上述目的，本发明还采用如下技术方案一种pcr扩增检测方法，其包括如下步骤：(1)构建pcr反应体系，包括：buffer溶液；datp溶液；dctp溶液；dgtp溶液；dttp溶液；与检测样品互补的上游引物、下游引物与探针；双热启动dna聚合酶，由化学修饰热启动taq酶和纳米抗体封闭热启动taq酶按照浓度1:1比例混合而成；(2)将pcr反应体系与检测样品混合进行pcr扩增；(3)获取pcr扩增后的循环阈值，并根据循环阈值确认所述检测样品的待检测物的量。该pcr反应体系还具有逆转录酶，逆转录酶的浓度是双热启动dna聚合酶浓度的20倍。datp、dctp、dgtp、dttp的浓度为0.5mmol/l，上游引物、下游引物的浓度为0.5μmol/l，探针的浓度为0.125μmol/l，化学修饰热启动taq酶与纳米抗体封闭热启动taq酶的浓度为0.5u/ul。datp、dctp、dgtp、dttp的浓度为0.5mmol/l，上游引物、下游引物的浓度为0.5μmol/l，探针的浓度为0.125μmol/l，化学修饰热启动taq酶与纳米抗体封闭热启动taq酶的浓度为0.5u/ul，逆转录酶浓度为10u/ul。上游引物：5′-cgtgatcctttgccagacact-3′；下游引物：5′-tcggtcgggctacacagggtca-3′；探针：5′-fam-atccgactgtggcatacgtgcacgtg-bhq1-3′。相比现有技术，本发明一种含有纳米抗体的双热启动dna聚合酶的有益效果在于：选用纳米抗体制备热启动taq聚合酶形成双热启动dna聚合酶，不仅可以模拟聚合酶单克隆抗体应用于热启动pcr，还能够在功能上取代稳定性差的单克隆抗体，并且大大降低了制备成本。【附图说明】图1为本发明第一实施例中三种热启动taq酶检测tb的pcr扩增曲线对比图。【具体实施方式】本发明为一种含有纳米抗体的双热启动dna聚合酶，该双热启动taq酶为化学修饰热启动taq酶和纳米抗体封闭热启动taq酶按照浓度1:1比例混合。采用该双热启动taq酶对各样品进行pcr扩增。实施例一：取1ml浓度为1e+6copies/ml的tb临床样本，使用凯杰生物工程(深圳)有限公司生产的“核酸提取或纯化试剂进行核酸提取。获得的tb核酸溶液，用水梯度稀释至1e+5copies/ml、1e+4copies/ml、1e+3copies/ml，获得不同浓度的tb核酸溶液。构建pcr反应体系其中：上游引物：5′-cgtgatcctttgccagacact-3′下游引物：5′-tcggtcgggctacacagggtca-3′探针：5′-fam-atccgactgtggcatacgtgcacgtg-bhq1-3′。分别使用双热启动taq酶、化学修饰热启动taq酶、纳米抗体封闭热启动taq酶，按照上述配方配制tbpcr反应体系，其中，化学修饰热启动taq酶和纳米抗体封闭热启动taq酶，两者按照浓度1:1比例混合形成双热启动taq酶。纳米抗体是经基因工程改造过的仅具有可变区的新型工程抗体，它缺失轻链，分子量小、稳定性好、易表达。选用纳米抗体制备热启动taq聚合酶形成双热启动dna聚合酶，不仅可以模拟聚合酶单克隆抗体应用于热启动pcr，能够在功能上取代稳定性差的单克隆抗体，并且大大降低了制备成本。配制好的tbpcr反应体系与不同浓度的tb核酸溶液混合，在荧光定量pcr扩增检测：试剂终浓度pcr反应体系20μltb核酸溶液30μl终体积50μl三种热启动taq酶检测tb的ct值(循环阈值)结果详细ct值结果和pcr扩增曲线参见上表及图1。结果显示，添加双热启动taq酶的实验组，相比添加以化学修饰热启动taq酶或纳米抗体封闭热启动taq酶为单一组分的taq酶的实验组，ct值较小，荧光升幅更高。实施例二：取1.2ml浓度为1e+7iu/ml的hiv临床样本，使用凯杰生物工程(深圳)有限公司生产的“核酸提取或纯化试剂”，在qiasymphonysp/as自动化仪器平台进行自动化核酸提取。获得的hiv核酸溶液，用水梯度稀释至1e+6iu/ml、1e+4iu/ml、100iu/ml、50iu/ml、20iu/ml，获得不同浓度的hiv核酸溶液。构建rt-pcr反应体系试剂终浓度buffer溶液2.5×datp0.5mmol/ldctp0.5mmol/ldgtp0.5mmol/ldttp0.5mmol/l上游引物0.5μmol/l下游引物0.5μmol/l探针0.125μmol/l逆转录酶10u/ul热启动taq酶0.5u/ul其中：上游引物：5′-atcaagcagccatgcaaatgct-3′下游引物：5′-tgaagggtactagtagttcctgctatgtc-3′探针：5′fam-atgaggaggctgcagaitggga–mgb3′分别使用双热启动taq酶、化学修饰热启动taq酶、纳米抗体封闭热启动taq酶，按照上述配方配制rt-pcr反应液，其中，化学修饰热启动taq酶和纳米抗体封闭热启动taq酶，两者按照浓度1:1比例混合形成双热启动taq酶。逆转录酶的浓度是双热启动dna聚合酶浓度的20倍。配制好的反应体系与hiv核酸溶液混合，在荧光定量pcr仪上在不同条件进行扩增检测：试剂终浓度rt-pcr反应液20μlhiv核酸溶液30μl终体积50μl三种热启动taq酶检测hiv的ct值结果结果显示，添加双热启动taq酶的实验组，相比添加以化学修饰热启动taq酶或纳米抗体封闭热启动taq酶为单一组分的taq酶的实验组，ct值较小，并且在检测25iu/ml和50iu/ml这样的低浓度样本时，检出率更高，表现出了更好的灵敏度。因此，通过检测tb浓度梯度的核酸样本，比较双热启动taq酶和两种单一成分的热启动taq酶，双热启动taq酶的检测结果ct值更小，荧光升幅更高，表现出更优的检测效果；通过检测hiv浓度梯度的核酸样本，比较双热启动taq酶和两种单一成分的热启动taq酶，双热启动taq酶的检测结果ct值更小，能检出更多的低浓度样本，表现出了更好的灵敏度。以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。当前第1页12