中断缺失的高产安丝菌素菌株及其制备方法与流程

本发明涉及生物医药领域，具体说是一种高产安丝菌素的菌株以及该菌株的制备方法，该方法主要是通过敲除珍贵束丝放线菌atcc31280基因组中n位糖基转移酶的表达基因ansa30，以消除n位糖基化对n位甲基化途径的竞争作用，使氨甲酰化安丝菌素糖苷acgp-3积累消失，而代谢流更多的流向目标产物，从而提高了安丝菌素的产量。

背景技术：

安丝菌素(又名安丝霉素或安莎霉素)是由珍贵束丝放线菌（actinosynnemapretiosum）产生的一种大环内酰胺类抗生素，属于微生物来源的美登素类分子，其组分有p-0、p-1、p-2、p-3、p-3'、p-4和p-4'，其中安丝菌素p-3（ap-3，1）为主要发酵产物，安丝菌素能够与微管蛋白的β亚基结合，通过阻碍微管形成，从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂使细胞死亡，在体外及荷瘤动物中具有显著的抗肿瘤作用。例如，immunogen，inc.公司的chari等人通过在c-3位酯链上连接二硫键形成的dm1分子，经dtt还原后可与不同的抗体连接形成抗体结合分子。目前，安丝菌素多种dm1抗体结合分子已经进入不同的临床实验阶段。其中，由罗氏公司开发的用于治疗人类乳腺癌的trastuzumabemtansine（即t-dm1）已经成药上市。

现有技术中，其中一种安丝菌素生物合成的方法主要包括起始单元3-氨基-5-羟基苯甲酸（ahba）的合成（葡萄糖为前体），随后在i型聚酮合酶（pksi）催化作用下，加载7个延伸单元-3个乙酸单元（丙二酰coa提供），3个丙酸单元（甲基丙二酰coa提供），1个糖基（glycolate）延伸单元（2-羟甲基-acp提供，来源于糖酵解途径），形成十九元大环内酰氨，最后经过一系列的后修饰过程，包括：氯代、氧甲基化、氨甲酰化、酰化、环氧化、n-甲基化（sam依赖）形成安丝菌素。但是，其中由糖基转移酶ansa30催化的n-糖基化反应为n-甲基化反应的竞争途径，导致atcc31280液体发酵液中，分支产物-氨甲酰化安丝菌素糖苷acgp-3（4＂-o-carbamoyl-ansamitocinosidep-3）积累。副产物的形成影响了目标产物的产量。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高产安丝菌素的菌株、该突变株的制备方法以及通过该突变株高产安丝菌素的方法。该突变株基于中断n-甲基转移酶表达基因ansa30的表达，以消除代谢途径中n糖基化对n甲基化的竞争，将代谢流更多地导向目标产物的合成，从而提高安丝菌素的产量。

为此，本发明提供了如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种中断缺失的高产安丝菌素的菌株，其技术要点是：所述菌株的n位糖基转移酶基因ansa30不表达。

进一步的，突变株（nxj-22）由菌株atcc31280制备得到。

另一方面，本发明还提供了该中断缺失的高产安丝菌素菌株的制备方法，其技术要点是，包括以下步骤：

步骤1）构建用于ansa30中断缺失的同源重组质粒载体；

步骤2）将步骤1）构建得到的质粒载体通过接合转移导入受体菌中进行同源重组；

步骤3）通过验证硫链丝菌素抗性或pcr产物片段大小的差异的方法筛选ansa30基因中断缺失的突变株。

进一步的，质粒载体由质粒pjtu1278制备。

进一步的，受体菌为atcc31280。

进一步的，步骤1）中，由两组引物通过pcr扩增得到ansa30中断区域左侧及右侧的同源臂。

进一步的，步骤1）中，在质粒spei/hindiii位点插入中断区域左侧1440bp的pcr片段(spei/ecori)，在中断区域右侧1465bp的pcr片段(ecori/hindiii)。

左同源臂的序列为：

ccgacgactgacccgccaccggggacgggggccgaccggaatcccggtcggcccccgtccgcgttccaggggggggcgagtcacgcgggttcaggaccgggccgcgcgcaccccgtcccgcaccgcccccgtcacccggtgcgccccgctcaccagcgaggtcaccagctcccccggcctgggcgcccgagccagcagcgccgtcaccgggctggactccagcacccgccccggatacgccccgtgcacccgcccgtcctcgtccaccggcgagtccacgttgtccacgccgttgtccggcagctccgaccgcatccccgaccggccgaccgcgcgcaccgacatcagcgcgtccgtgagcgccgggaacagccgctgccccaggtagaacgcgagcgccgcgtcacccaccggcacctcgcggcgggggcgttcggcggcgcgcagcacggcctcagcgaccagctccggcgcgtacaccggaggcggcggctcgggcagcgagccgacgcggctgcggcagtgctcgaagaacgggctgttgatcgcggcgggcagcacggcggtgaccgcgatcggctcgccgtcgtgggccagctccacccgcagcgcgtcgtagaacgcccgcaccgccgccttgctggccgcgtacggggcctggagcggcgccgagcgcagcccgagcacggacgcgaccccgatcagcactcctccgcccgcccggcgcagcgcgggcagcgcggccttggccccgtgcacgtgcccgaggtagttgacccgcatcacccggtcgaactcctcggcgggggtgtcctccacccgcccgtacacgccgatcccggccgcgttcacccaggtgtccacccgcccgaaccgctccaccgccacctcggcgaccgcgcgcaccgcggcctcgtcggcgatgtccgccgtcaccgcgaccgcaggcccacccgcgtcccggacctcctcgaccagcccgtcgagcgcgcgggtgttgcgcgccgcgcacaccacgcgcgcccccgccgccgcgaaccgcagcgcggtgacccgcccgatccccgacgacgcgcccaccacgacgacgacctgctccgccaacctcctgggcatgtgacctctccgtcccggatcgtgaaatgcggcgggtacccggcgggaggccgtccacgcgtcccggagggatggtccgcgcggacggcgggtggtccggatcggaggcgggccctcgaccccggcagtccgatcagcgcacgaccgaccagggcgcggccgtccagcgcacgaccatccagcacgcgaccgaccagggcgcgaccgaccagcacgcggccgtccgccccggacccggacacccggcaccccgcacggcccgcgcggtcacaccgccgcgacgctccgcgcggcctccgcgatctgctccaggcgggtcaccac；

或者/和右同源臂的序列为：

gacggtcaggcagggcagcccgcgctcctccgcgacgagcagcccggccagctccatgccgtcgcgcaggaccaggtcgggccggaagcggtcgacgacggggcgcagcccggccagcgcctcccgcagcagcggcctgcccgcgatgacgtcgacgatcgcgtcgacgccggggtagtcggtgcccggcctggccggtggcacgacgcccccgagccgctccacccagaacctcgcctggtcgggcagcgcctcgaccgagggcaggccgctgccccgcaggcccggtgcggcgctgggggccgtggccacgagcacctcgtgcccggcgtccaggaccgcgcgcccgagcacgagcatctcgtgcgcgtgcgacggggccccggtgacggtgaacagaacgcgcaactgtcttcctccgtgctggggcccgccgcgcggcgggccccggtggtgaagggccgcgggtgcggccccgaaccggtcaggtccgctcggcgcggcccagccgggtgtcgatgaactcgaacagctccgccacgcccgcgtcccggagcgcggccccgccgtcgggctcgccctggtcctcgtcggacagggcggcgagcagggcgcgcagcctggcggcggcgctcgcgcgcagcgcggggtcggcgggcgggtcggcgagcgcggcctccaggcggtccaggcccgaggtcaccgggtcgccgccgtcgagcagccccgccaacacggcggcgacctcggccgccgtcgggtggtcgaacagcagggtcgcgggcagggtcaggccggtggcggcggccaggcggtcgcgcagctccaccgccgtcatcgagtcgaaccccaggtcccggaacgcggcccgcccgtccaccgaaccgtcggcgcggcccagcacggcggcggcgtggtcgcgcaccagcgccagcagcacccggtcccggtccgggccggtcaggtcgaccgcgctcggctccggggcgctccgctgctcgggcagcgccacccctggcagcgccccctcggacagcactcccccggacagcgcggcttccgacgtccgcgcgaacacgaccacgcccagctccgggctcagcggcggcacacccggtcccgcgcacagcagggtcgcgggcaggccgtcctcgtggcggcggcgcacgagcgcggccagcaccccggcggccaccgcgtcctcggggcgcgccgcgtcgccgagcgcgcccgccgggccgcacagcgcgaacagcgcgggcggccggtcgcgggtcagctcgtccagcagcgcggcccgcgccaggcccgcgtcgtccggctcgacggcgagcaccacccagtccgggcggtgcccctccagcgcggccaccagctcctccctgccggggtcggcgggcagcacgaccggttcgcgcaccccgcaggccgccaccacgccgcgcgccgcctccccgaccaccag。

此外，本发明还提供了一种采用上述突变株制备安丝菌素的方法，其技术要点是，包括以下步骤：将突变株的菌丝体移入一级种子培养基中，30℃220r/min条件下培养24h；按4%接种量转接至二级种子培养基中，30℃220r/min条件下培养24h；按10%接种量转接至发酵培养基发酵7d。

进一步的，上述安丝菌素的制备方法中：

一级种子培养基包括tsb3w/v%，酵母提取物0.5w/v%，蔗糖5w/v%；

或者二级种子培养基包括tsb3w/v%，酵母提取物0.5w/v%，蔗糖2.5w/v%，异丁醇0.05v/v%，异丙醇0.05v/v%，淀粉1w/v%；

或者发酵培养基包括酵母提取物0.8w/v%，麦芽提取物1w/v%，蔗糖1.5w/v%，异丁醇0.5v/v%，异丙醇1.2v/v%，淀粉2.5w/v%，mgcl22mm。

本发明的有益效果：现有技术中，野生型菌株通常选用珍贵束丝放线菌atcc31565，该菌种在固体培养基中培养时安丝菌素糖苷agp-3积累。本发明的野生型菌株选用珍贵束丝放线菌atcc31280，其在液体培养基中培养时氨甲酰化安丝菌素糖苷acgp-3积累。二者出发菌株、培养条件和副产物积累均不同。atcc31565的asm25中断缺失所用质粒为phgf9053，而本发明中，atcc31280的ansa30基因中断缺失所用质粒为pjtu1278。

atcc31565的糖基转移酶基因为asm25，而本发明中，atcc31280的ansa30基因编码糖基转移酶，虽然，二者序列有97%同源，但却产生了显著的区别。具体而言，虽然atcc31565中asm25中断缺失后，agp-3积累消失，但是并未涉及ap-3产量变化。而本发明中，atcc31280的ansa30中断缺失后，acgp-3积累消失，使ap-3产量显著提高了68%。

综上所述，本发明通过在染色体上置换的方法，使得ansa30基因中断缺失，消除n位糖基化反应对n位甲基化反应的竞争，使得代谢流更多地流向目标产物以此来提高安丝菌素产量，最终安丝菌素产量对比野生型菌株提高了68%，达到至少74mg/l。因此，通过本发明可显著提高安丝菌素的发酵产量，同时使发酵成本大幅降低。

附图说明

图1为野生型菌株atcc31280中ansa30基因失活得到突变株nxj-22示意图；

图2为ansa30中断缺失菌株的pcr验证结果示意图；

图3为突变株nxj-22与野生菌株atcc31280的安丝菌素的产量对比示意图。

具体实施方式

以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。虽然以下给出了本发明优化的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法的，按照常规条件或制造厂商的建议条件。

实施例1

本实施例为制备基因ansa30中断缺失的突变株nxj-22的具体过程。具体包括以下步骤：

步骤1），构建质粒plq578：以珍贵束丝放线菌atcc31280的基因组dna为模板，分别使用两组引物del30-l-f/del30-l-r、del30-r-f/del30-r-r通过pcr扩增得到ansa30中断区域左侧1440bp的同源臂以及右侧1465bp的同源臂，通过基因测序确认同源臂的正确性。在质粒pjtu1278的spei/hindiii位点插入来自中断区域左侧1440bp的pcr片段(spei/ecori)和中断区域右侧1465bp的pcr片段(ecori/hindiii)。由此得到用于ansa30基因失活的质粒plq578，酶切验证表明质粒构建正确。

*步骤1）中左右同源臂基因片段制备所采用的pcr体系及条件：

pcr反应体系为：dna模板30ng，引物30pmol，50%dmso3ml，25mmmg²⁺2ml，缓冲液3ml，kod聚合酶1个单位，加纯水补齐至30ml；

pcr条件为：95℃5min；95℃30s；60℃30s；68℃90s；循环30次；68℃10min。

*步骤1）所用到的引物碱基序列如下：

*本发明涉及的各内切酶识别位点（酶切位点）如下：

步骤2）将质粒plq578导入野生型菌株atcc31280进行重组，并通过筛选得到ansa30中断缺失突变株。具体包括以下步骤：

将质粒plq578通过接合转移导入宿主et12567(含有质粒puz8002)中。取制得的et12567于含有amp、kan和chl三种抗生素的lb溶液中，37°c过夜培养，用相同的培养基，将过夜培养物按10%的比例转接一次并培养2.5h，然后用新鲜的lb溶液漂洗菌体以除去培养物中的抗生素。同时制备野生型菌株atcc31280的新鲜菌丝体（约16h培养物），用lb溶液洗2~3次之后，将其与之前制备的宿主菌et12567混合(菌丝体细胞和宿主菌的比例约为1：10)均匀后涂布于含有10mmmg²⁺的ymg平板，待ymg平板吹干后转移至37°c培养箱倒置培养12h后取出平板，分别取硫链丝霉素和萘啶酮酸两种抗生素的储存液30ml和40ml加入1.5ml无菌水中混匀后覆盖在ymg平板上，将平板晾干后转移至30°c培养箱中培养。一般3~5d后可见平板上有单菌落接合子长出，将其通过平板涂布于含有硫链丝霉素和萘啶酮酸两种抗生素的ymg平板扩大培养（此时生长的一般为单交换接合子），将平板扩大培养的接合子挑取少量至无抗的tsby溶液进行两轮松弛，利用引物del30-f/r，通过菌丝体pcr验证接合子，其中pcr若只有一条带（1194bp），为回复成野生型的菌株，若含有450bp的一条带，则为双交换突变株，若含有450bp和1194bp两条带，则为单交换突变株。其中双交换突变株即为ansa30基因中断缺失的突变株。

如图2所示，泳道1~3分别为三个接合子pcr条带，泳道1和泳道2含有450bp一条带，为双交换突变株；泳道3含有两条带，为单交换突变株；et为正对照；wt为野生型（atcc31280）对照（1194bp）。

*步骤2）中突变株筛选是所采用的pcr体系及条件：

pcr体系：dna模板10~100ng，引物30pmol，50%dmso3ml，缓冲液3ml，taq聚合酶0.5个单位，加纯水补齐至30ml；

pcr条件：95℃5min；95℃30s；60℃30s；72℃1min；循环30次；72℃10min。

*步骤2)中所用到的引物碱基序列如下：

通过上述过程，质粒plq578将野生型菌株atcc31280中的ansa30基因内部区域失活，即可得到ansa30中断突变株nxj-22。

实施例2

本实施例为通过ansa30中断缺失的突变株生物合成安丝菌素的发酵过程。具体包括以下步骤：将突变株（nxj-22）涂布于固体ymg培养基活化，30℃培养2d后，挑取少量菌丝体接种至一级种子培养基，30℃220r/min培养24h；按4%接种量转接至二级种子培养基中，30℃220r/min条件下培养24h；按10%接种量转接至发酵培养基发酵，7d后收集发酵液进行萃取，并使用安捷伦公司的agilent1200系列对萃取后的化合物进行hplc分析。其中，hplc的流动相为甲醇和水溶液。

表1种子培养基及发酵培养基的成分构成

图3为ansa30基因缺失菌株nxj-22与野生型菌株atcc31280安丝菌素发酵水平检测。结果表明ansa30基因中断缺失之后，安丝菌素的发酵产量和出发菌株相比提高68%，终产量可达74mg/l。

本发明所涉及的质粒pjtu1278已经在sci数据库文献《hey，wangz，bail，liangj，zhoux，dengz:twophz1358derivativevectorsforefficientgeneknockoutinstreptomyces.journalofmicrobiologyandbiotechnology2010，20(4):678-682.》中记载。

本发明所涉及的菌株atcc31280已在文献《panwenqin,kangqianjin,wanglei,bailinquan&dengzixin:asm8,aspecificlal-typeactivatorof3-amino-5-hydroxybenzoatebiosynthesisinansamitocinproduction.sciencechinalifesciences2013(7)：601-608》中记载。

序列表

<110>辽宁斯韦尔生物科技有限公司

上海交通大学

<120>中断缺失的高产安丝菌素菌株及其制备方法

<130>17-0836

<141>2017-09-25

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1209

<212>dna

<213>珍贵束丝放线菌ansa30(actinosynnemapretiosum)

<400>1

ttgcgcgttctgttcaccgtcaccggggccccgtcgcacgcgcacgagatgctcgtgctc60

gggcgcgcggtcctggacgccgggcacgaggtgctcgtggccacggcccccagcgccgca120

ccgggcctgcggggcagcggcctgccctcggtcgaggcgctgcccgaccaggcgaggttc180

tgggtggagcggctcgggggcgtcgtgccaccggccaggccgggcaccgactaccccggc240

gtcgacgcgatcgtcgacgtcatcgcgggcaggccgctgctgcgggaggcgctggccggg300

ctgcgccccgtcgtcgaccgcttccggcccgacctggtcctgcgcgacggcatggagctg360

gccgggctgctcgtcgcggaggagcgcgggctgccctgcctgaccgtcccctcgggcacg420

acgaaccagctcgacccggccgccgtgctgccccggctcaacgagcgccgcgccgagcag480

gacctgcccacctcggccgacccgctcagcgcgcaccggcacggccacgtcgactgcctg540

ccgcgcgagtactccctgctcggcgtcccgctcagcccctgcctggcctaccggccgccg600

tcgcccgagggccggtcgctgcccgcgtggctggcagacctggacccgtcccgcccgctg660

gtgtacggggcggtcggcatcgcgctggccgccacctggcgccgcgacgacgtgaccgcg720

ctggccgccgacccggtggaggcgctgagcggcctcgtggccgcgctgtccgaggtggac780

tgcgccgcggtggtgtccaccggcggcatcccggtcgaccgcgtcccgccgggcgcgccg840

cacgtgcgcgtggtcgagcgggcgccccagccgctgctgctggagtgcgcgcagctgttc900

gtcacccacgccggggccaacagcgtgcgcgaggcggtgcgggcgggggtgccgatggtc960

gccgccccgctgttcggcgaccagccgcacaacgccgccagggtcgccgcgctggggctg1020

ggcgtgcgggtggtggacggctcgcccgccgacctggcggacgcctgccggaccgtgctg1080

gccgatcccggtttcaccgccagggcgcgccacgcgcgccggaccctgctcgcgctgcct1140

ccggtgggcgaggtggtgacccgcctggagcagatcgcggaggccgcgcggagcgtcgcg1200

gcggtgtga1209

<210>2

<211>1440

<212>dna

<213>左同源臂(pcr片段质粒spei/hindiii)

<400>2

ccgacgactgacccgccaccggggacgggggccgaccggaatcccggtcggcccccgtcc60

gcgttccaggggggggcgagtcacgcgggttcaggaccgggccgcgcgcaccccgtcccg120

caccgcccccgtcacccggtgcgccccgctcaccagcgaggtcaccagctcccccggcct180

gggcgcccgagccagcagcgccgtcaccgggctggactccagcacccgccccggatacgc240

cccgtgcacccgcccgtcctcgtccaccggcgagtccacgttgtccacgccgttgtccgg300

cagctccgaccgcatccccgaccggccgaccgcgcgcaccgacatcagcgcgtccgtgag360

cgccgggaacagccgctgccccaggtagaacgcgagcgccgcgtcacccaccggcacctc420

gcggcgggggcgttcggcggcgcgcagcacggcctcagcgaccagctccggcgcgtacac480

cggaggcggcggctcgggcagcgagccgacgcggctgcggcagtgctcgaagaacgggct540

gttgatcgcggcgggcagcacggcggtgaccgcgatcggctcgccgtcgtgggccagctc600

cacccgcagcgcgtcgtagaacgcccgcaccgccgccttgctggccgcgtacggggcctg660

gagcggcgccgagcgcagcccgagcacggacgcgaccccgatcagcactcctccgcccgc720

ccggcgcagcgcgggcagcgcggccttggccccgtgcacgtgcccgaggtagttgacccg780

catcacccggtcgaactcctcggcgggggtgtcctccacccgcccgtacacgccgatccc840

ggccgcgttcacccaggtgtccacccgcccgaaccgctccaccgccacctcggcgaccgc900

gcgcaccgcggcctcgtcggcgatgtccgccgtcaccgcgaccgcaggcccacccgcgtc960

ccggacctcctcgaccagcccgtcgagcgcgcgggtgttgcgcgccgcgcacaccacgcg1020

cgcccccgccgccgcgaaccgcagcgcggtgacccgcccgatccccgacgacgcgcccac1080

cacgacgacgacctgctccgccaacctcctgggcatgtgacctctccgtcccggatcgtg1140

aaatgcggcgggtacccggcgggaggccgtccacgcgtcccggagggatggtccgcgcgg1200

acggcgggtggtccggatcggaggcgggccctcgaccccggcagtccgatcagcgcacga1260

ccgaccagggcgcggccgtccagcgcacgaccatccagcacgcgaccgaccagggcgcga1320

ccgaccagcacgcggccgtccgccccggacccggacacccggcaccccgcacggcccgcg1380

cggtcacaccgccgcgacgctccgcgcggcctccgcgatctgctccaggcgggtcaccac1440

<210>3

<211>1465

<212>dna

<213>右同源臂(pcr片段质粒ecori/hindiii)

<400>3

gacggtcaggcagggcagcccgcgctcctccgcgacgagcagcccggccagctccatgcc60

gtcgcgcaggaccaggtcgggccggaagcggtcgacgacggggcgcagcccggccagcgc120

ctcccgcagcagcggcctgcccgcgatgacgtcgacgatcgcgtcgacgccggggtagtc180

ggtgcccggcctggccggtggcacgacgcccccgagccgctccacccagaacctcgcctg240

gtcgggcagcgcctcgaccgagggcaggccgctgccccgcaggcccggtgcggcgctggg300

ggccgtggccacgagcacctcgtgcccggcgtccaggaccgcgcgcccgagcacgagcat360

ctcgtgcgcgtgcgacggggccccggtgacggtgaacagaacgcgcaactgtcttcctcc420

gtgctggggcccgccgcgcggcgggccccggtggtgaagggccgcgggtgcggccccgaa480

ccggtcaggtccgctcggcgcggcccagccgggtgtcgatgaactcgaacagctccgcca540

cgcccgcgtcccggagcgcggccccgccgtcgggctcgccctggtcctcgtcggacaggg600

cggcgagcagggcgcgcagcctggcggcggcgctcgcgcgcagcgcggggtcggcgggcg660

ggtcggcgagcgcggcctccaggcggtccaggcccgaggtcaccgggtcgccgccgtcga720

gcagccccgccaacacggcggcgacctcggccgccgtcgggtggtcgaacagcagggtcg780

cgggcagggtcaggccggtggcggcggccaggcggtcgcgcagctccaccgccgtcatcg840

agtcgaaccccaggtcccggaacgcggcccgcccgtccaccgaaccgtcggcgcggccca900

gcacggcggcggcgtggtcgcgcaccagcgccagcagcacccggtcccggtccgggccgg960

tcaggtcgaccgcgctcggctccggggcgctccgctgctcgggcagcgccacccctggca1020

gcgccccctcggacagcactcccccggacagcgcggcttccgacgtccgcgcgaacacga1080

ccacgcccagctccgggctcagcggcggcacacccggtcccgcgcacagcagggtcgcgg1140

gcaggccgtcctcgtggcggcggcgcacgagcgcggccagcaccccggcggccaccgcgt1200

cctcggggcgcgccgcgtcgccgagcgcgcccgccgggccgcacagcgcgaacagcgcgg1260

gcggccggtcgcgggtcagctcgtccagcagcgcggcccgcgccaggcccgcgtcgtccg1320

gctcgacggcgagcaccacccagtccgggcggtgcccctccagcgcggccaccagctcct1380

ccctgccggggtcggcgggcagcacgaccggttcgcgcaccccgcaggccgccaccacgc1440

cgcgcgccgcctccccgaccaccag1465

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>引物(del30-f)

<400>4

cccggcagtccgatcagc18

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>引物(del30-r)

<400>5

cccgaccaggcgaggttc18