一种免疫细胞无血清培养基及其制备方法与流程

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种免疫细胞无血清培养基及其制备方法和用途。

背景技术：

细胞因子诱导的肿瘤杀伤细胞(ciks)是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养而获得的一群异质细胞群，因其兼具有t淋巴细胞强大的抗瘤活性和nk细胞的非主要组织相容抗原(mhc)限制性杀瘤特点，从而成为肿瘤过继免疫治疗的重要手段之一。cik细胞由于具有较强的增生能力和细胞毒性且杀瘤谱广而受到广泛的重视，在一些实体瘤、血液肿瘤及血液病骨髓移植后的免疫治疗中已显示出良好的应用前景。能否获得足够数量的效应细胞及效应细胞的杀伤活性与cik细胞治疗的临床疗效有着密切的关系。研究已表明，cik的主要效应细胞为cd3+/cd56+双阳性细胞。cik细胞培养后cd3+/cd56+细胞所占细胞总数的比例是重要观察指标。

传统对cik细胞治疗的通用流程是将患者外周血中采集的单个核细胞在体外经ifn-γ、cd3单抗、il-1α以及il-2修饰、刺激、培养、增殖后回输到患者体内，从而杀伤肿瘤。目前培养方法细胞增殖慢、倍增时间长、cd3+/cd56+双阳性细胞比率不稳定。大部分实验室体外培养人免疫细胞主要以添加人ab血清或fbs来维持免疫细胞生长。但动物或人血清中含有病原体或不确定物质，再加上人ab血清来源困难，会对培养细胞带来危险或不确定的危害。并且传统培养基成分不稳定无法进行后期质量控制，无法在工业上大规模生产。因此亟需开发能克服上述缺陷的无血清培养基。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种免疫细胞无血清培养基及其制备方法和用途。该培养基对人体安全，并能提高cik细胞表型(cd3+cd56+)双阳性率的培养基。

一种免疫细胞无血清培养基，培养基成分包括基础培养基、聚胺、胰岛素、胆固醇、枸橼酸铁、肌醇和抗氧化剂；所述基础培养基是rpmi-1640。

每升培养基包括：胆固醇13.2mg/l；胰岛素20mg/l；枸橼酸铁2mg/l；nahco32g/l；乙醇胺1.22mg/l；亚油酸1mg/l；肌醇19mg/l；左旋谷氨酸584mg/l；丙酮酸钠110mg/l；2巯基乙醇0.78mg/l；1硫代甘油5.41mg/l；非必须氨基酸20ml/l；维生素10ml/l；聚胺添加物3.31mg/l；抗氧化剂0.52mg/l；油酸1mg/l。

所述非必须氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸中的一种或一种以上。

所述维生素为维生素a，维生素b1，维生素b2，维生素pp，维生素b4，维生素b5，维生素b6，生物素，维生素b9，维生素b12，肌醇，维生素c，维生素d，维生素e，维生素k中的一种或一种以上。

所述培养基成分还包括il-15(白细胞介素15)，ifn-γ，cd3，il-1α，il-2因子中的一种或一种以上。

本发明的有益效果：本发明的无血清培养基对人体安全，能稳定cik细胞增殖速度和提高细胞cd3⁺cd56⁺，并且有成分简单、性状稳定、批间差异小、便于质控、诱导cik增殖效率高、cd3⁺cd56⁺的阳性比例高，培养获得的cik细胞质量稳定的优点，对于免疫治疗的推广应用具有重要意义。

附图说明

图1为1-3号培养基与实施例1的无血清培养基培养的cik细胞表型流式细胞术检测结果对比图；

图2为实施例1的无血清培养基与takara公司的h3培养基培养的cik细胞表型流式细胞术检测结果对比图。

图3为实施例1的无血清培养基在添加il-15之后，cik细胞表型流式细胞术检测结果对比图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

将一袋一升装rpmi1640(gibco)用超纯水搅拌溶解，依次加入下表所添加物质(表1)，最终定容至1l，搅拌溶解，调节ph值至7.0左右，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。其中ph值保持在6.8-7.2之间，最佳ph值保持在7.0。

表1.免疫细胞无血清培养基配制表

取患者外周血60ml，转入2支50ml离心管，2200rpm离心10min，吸取上层黄色血浆，转移至新的50ml离心管中，置于56℃灭活25min，4℃冷藏10min,3000rpm,4℃，离心15min，取上清分装后置于4℃保存备用。将下层红细胞缓缓加入已装有淋巴细胞分离液的2支50ml离心管中，400g离心30min。取中间层白色细胞，nacl清洗2次后，将细胞种于1-4号的培养基中，并添加ifn-γ，cd3，il-1α，il-2因子，继续培养14天。

1号培养基：rpmi1640。

2号培养基：rpmi1640+白蛋白。

3号培养基：rpmi1640+ultrakure。

4号培养基：rpmi1640+表一配方(c922)。

实施例2

前面培养基配制步骤和细胞培养步骤同实施例1。将细胞种于h3和培养基中，并添加ifn-γ，cd3，il-1α，il-2因子，继续培养14天。比较takara商品化的h3培养基与我们本实施例培养基对于细胞增值率、存活率和细胞表型方面的影响。

实施例3

前面培养基配制步骤和细胞培养步骤同实施例1。将细胞种于培养基和培养基外加白介素15(0.5ng/ml)中，并添加ifn-γ，cd3，il-1α，il-2因子，继续培养14天。比较il-15对我们本发明培养基对于细胞增值率、存活率和细胞表型方面的影响。

验结果表明，在培养14天后，cd3⁺cd56⁺双阳性细胞百分率：1-3号组均小于3％，4号培养基为27.2％(图1)。与商品化的h3对比，与h3组的细胞扩增率差不多，细胞存活率都在98％左右。但在细胞表型方面，h3组cd3⁺cd56⁺双阳性细胞百分率为17.3％，而4号培养基为23.7％(图2)。比h3提高了6个百分点。在4号培养基中添加了il-15(0.5ng/ml)可以有效提高cd3⁺cd56⁺双阳性细胞百分率，cik细胞活化率提高了一倍以上(图3)。

实施例4

前面培养基配制步骤和细胞培养步骤同实施例1。将细胞种于培养基和培养基外加苞藜提取物(3mg/l)中，并添加ifn-γ，cd3，il-1α，il-2因子，继续培养14天。比较苞藜提取物对我们本发明培养基对于细胞增值率、存活率和细胞表型方面的影响。

所述苞藜提取物的提取方法如下：将苞藜提取物叶片晒干，加3-5倍重量份数的水溶液回流提取3次，合并滤液，蒸干制成。

实施例5

前面培养基配制步骤和细胞培养步骤同实施例1。将细胞种于培养基和培养基外加环磷酰胺中，并添加ifn-γ，cd3，il-1α，il-2因子，继续培养14天。比较环磷酰胺il-15对我们本发明培养基对于细胞增值率、存活率和细胞表型方面的影响。

验结果表明，在培养14天后，cd3⁺cd56⁺双阳性细胞百分率：4号培养基为27.2％(图1)，实施例4为36.2％，实施例5为37.1％。在4号培养基中添加苞藜提取物和环磷酰胺可以有效提高cd3⁺cd56⁺双阳性细胞百分率，cik细胞活化率提高一倍以上。