本发明属于生物医药技术领域，本发明公开了一种植物淀粉品质改良重组基因gbssip:glgc及其应用。
背景技术：
淀粉是仅次于纤维素、目前存在最为普遍、价格最为低廉的光能聚合载体之一；淀粉组成单一、易于储藏、用途广泛，是用于建材、纺织、造纸和石油开采的重要工业原料，尤其是其储藏的化学能易于再转化利用，为此，在战略高度重新认识淀粉方兴未艾。
淀粉来自植物种子(如水稻、小麦和玉米等)、块茎(如马铃薯等)等，因食物成分和淀粉特性等原因，马铃薯淀粉是广泛接受和使用的工业原料；我国马铃薯产区淀粉出粉率(生产每公斤淀粉所需块茎量)为1/(7-8),而发达国家为1/(3-4)，生产效率低下，其原因是我国产区淀粉含量仅为15％-18％。
育种是改良或获得品种的基本途径，其依据的原理是孟德尔和摩尔根的遗传原理，杂交是实现性状决定基因重组的基本途径，在欧美马铃薯杂交育种获得了目前80％以上广泛种植的品种，其中，用于淀粉加工目的的品种的淀粉含量均为20％以上。
在西欧，苏格兰农业科学咨询机构官方(爱丁堡)负责维护的欧洲马铃薯品种数据库，库中收集并详细记载了杂交育种获得品种的相关专利；hzpc、jalving、averis等是西欧主要的育种公司，其育种创制的马铃薯品种agria、desiree、bintje、ladyrosetta等被广泛栽培。
由北美联合培育的russet系列品种广泛应用，由此产生的专利包括pat.no.5,500,365,pat.no.5,387,756,pat.no.5,789,657,pat.no.5,503,999,pat.no.5,589,612,pat.no.5,510,253,pat.no.5,304,730,pat.no.5,382,429,pat.no.5,503,999,pat.no.5,648,249,pat.no.5,312,912,pat.no.5,498,533,pat.no.5,276,268,pat.no.4,900,676,pat.no.5,633,434,pat.no.4,970,168。
近年，在国际市场对淀粉巨大需求的驱动下，高出粉率、高粘度等高品质淀粉更是炙手可热，过去十多年，国际化工巨头、如荷兰avbe和德国basf等纷纷投资于淀粉品质改良的育种研究，在取得了许多育种成果，其中具有代表性的是获得了基因工程改良的马铃薯品种amflora。
amflora块茎淀粉中支链淀粉含量在95％以上，由amflora加工的淀粉，只需传统马铃薯淀粉用量的五分之一，即可达到同样的使用效果；迫于自然主义者的压力，欧盟多年来一直抵制在西欧种植转基因作物，但鉴于amflora淀粉的巨大诱惑，basf公司2010获欧盟授权，批准其在欧洲种植amflora。
淀粉不仅是人类生存所需食物的成分，由淀粉生产的燃料乙醇正在成为动力能源之一，因此，淀粉也是人类活动所需能源的组成部分，鉴于人们对淀粉含有的能量寄予的厚望，未来对淀粉的巨大需求显而易见，大幅增加植物淀粉积累，过去是、今天更是人类面临的重大课题。
淀粉由两类葡萄糖苷聚合物组成,一是葡萄糖alfa-1,4线性连接占绝大部分的直链淀粉,二是在alfa-1,4连接链有多处alfa-1,6分支连接的支链淀粉；直接参与淀粉的生物合成的主要酶有：腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(agpase.ec2.7.7.27))、可溶性淀粉合成酶(sss)、与淀粉粒结合的淀粉合成酶(gbss)、淀粉分支酶(be)、淀粉去分支酶(dbe)。
细菌agpase是由glgc基因编码的同源四聚体，高等植物的agpase是异源四聚体(异源四亚基复合体),两个相同的大亚基和两个相同的小亚基，小亚基(ss)行使agpase的代谢功能，大亚基(ls)主要调控agpase活性,变构因子诱导的异构调控是agpase主要的调控形式。
细菌agpase同源四聚体的单个亚基、植物agpase异源四聚体的小亚基在其以寡聚体状态存在时，其n端的代谢基团行使adp-葡萄糖合成的功能，即以磷酸葡萄糖和atp为底物，合成adp-葡萄糖，adp-葡萄糖是alfa-1,4或alfa-1,6糖苷链延伸的底物。
大肠杆菌k12突变菌株618中agpase亚基g336d突变使其agpase活力提高33％，在35s启动子驱动下，表达618菌株agpase编码基因glgc16马铃薯体内，agpase活力和块茎淀粉含量提高30％以上，表达g336d突变glgc木薯体内，使其agpase活力提高70％，块根淀粉含量提高2倍以上。
研究业已表明，植物agpase小亚基以寡聚体形式存在时表现活性，推动淀粉合成，当两小亚基第82位半胱氨酸间形成分子内二硫键(二聚体)时agpase失活，抑制淀粉合成；众多变构因子影响植物agpase小亚基第82位半胱氨酸的氧化还原状态，使其对调控敏感。
细菌agpase取代植物agpase，未见agpase代谢亚基二聚体形成，淀粉合成不受抑制，这也是glgc16马铃薯体内表达提高agpase活力的原因。植物体内agpase编码基因转录、agpase活力和淀粉合成三者中，agpase表达水平和其活力水平变化弹性强提高植物agpase活力是增加淀粉生物合成的途径。
然而，在进一步实验中发现，用patatin启动子驱动glgc16在马铃薯体内表达，虽然转化株系体内的agpase活力显著增强，但块茎淀粉含量和对照无显著差异,即glgc16植物体内表达结果无法再现。其中可能原因包括glgc16自身和启动子等方面。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，获得既可提高agpase活力，又可在不同基因型中再现增强淀粉生物合成的glgc，本发明提供一种植物淀粉品质改良重组基因gbssip:glgc及其应用。
本发明具备以下特征，1)重组基因含有glgc，分别由gbssi启动子驱动表达；2)重组基因植物体内表达，块茎内agpase活力可比对照提高80％以上，3)重组基因植物体内表达，可使马铃薯块茎淀粉含量高于对照45％以上、淀粉粘度高于对照80％以上。
其具体技术方案为：
一种植物淀粉品质改良重组基因gbssip:glgc，其核苷酸序列如seqidno:1所示。、一种植物淀粉品质改良重组基因gbssip:glgc在淀粉品质改良过程中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
经体内外多次反复不同宿主基因型实验表明，glgc55植物体内表达可同时提高agpase含量和贮藏器官淀粉合成，且不需在其末端添加转运肽编码序列，克服了glgc16结果无法再现的不足。
附图说明
图1是重组基因gbssip:glgc示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
本发明从大肠杆菌jm109-3突变株中分离得到了glgc55(genbank:ay943834)dna，从马铃薯分离获得了gbssi启动子dna。
glgc55编码431个氨基酸组成的agpase亚基(aay18580)，其中有4处特异突变，它们分别是k39e,v71a,i248v和k304e，前两者出现在寡聚亚基n端代谢基团的rossmann折叠区域内，后两者出现在寡聚亚基c端异构调控和寡聚化的lbh基团内。
本发明运用分子克隆技术用glgc55与gbssi启动子，构建了重组基因gbssip:glgc，gbssip:glgc定义为gbssi启动子驱动的glgc55、植物体内表达可增加淀粉合成的重组基因，其组成示意如图1所示。
目的glgc获得
按照lee等的方法提取大肠杆菌jm109基因组dna，以其为模板，按照《分子克隆实验指南》p672-683的方法，以glgc-f：5’-gagttagccatggttagtttagag-3’，glgc-r：5’-aaagatctctgaacatacatg-3’.为引物，在95℃预变性4min、95℃变性30sec、53℃退火45sec、72℃延伸1min、反应30个循环、最后72℃延伸10min、4℃保存的反应条件下进行pcr，pcr产物纯化回收(promega；wizardsvgelandpcrclean-upsystem)后，用回收产物和pgem-t载体(promega，pgem-tvectorsystems,a1360)建立连接反应，按照pgem-t载体说明书的方法，将连接产物转化dh5α(takara公司)感受态细胞，将转化后的感受态细胞均匀涂布于含氨苄青霉素的lb固体琼脂平板上，37培养12小时后挑选白色菌落，接种于含有氨苄青霉素的液体lb培养基中，振荡培养12小时。按照《分子克隆实验指南》p19-23的方法，提取菌液质粒dna，充分洗涤后，用ncoi和bglii双酶切鉴定，鉴定正确的单克隆所含质粒为pc-glgc，扩大培养含pc-glgc重组菌，并对pc-glgc中目的glgc测序，测序结果在genbank注册，其注册号为ay943834。
gbssi启动子的获得
按照《分子克隆实验指南》p672-683的方法，ctab方法提取马铃薯基因组dna，并其为模板，以ph-f：5’-tccttccttttagcagtgtatcaat-3’，ph-r：5’-gaacttgatctttgtgggt-3’为引物，设置95℃预变性4min、95℃变性30sec、53℃退火45sec、72℃延伸1min、反应30个循环、最后72℃延伸10min、4℃保存的反应条件进行pcr，pcr产物纯化回收(promega；wizardsvgelandpcrclean-upsystem)后，用回收产物和pgem-t载体(promega，pgem-tvectorsystems,a1360)建立连接反应，按照pgem-t载体说明书的方法，将连接产物转化dh5α(takara公司)感受态细胞，将转化后的感受态细胞均匀涂布于含氨苄青霉素的lb固体琼脂平板上，37培养12小时后挑选白色菌落，接种于含有氨苄青霉素的液体lb培养基中，振荡培养12小时。按照《分子克隆实验指南》p19-23的方法，提取菌液质粒dna，充分洗涤后，《分子克隆实验指南》p237-259的方法，用ncoi和bglii(takara公司)双没切鉴定，鉴定正确的单克隆所含质粒为pg-gbssip，扩大培养含pg-gbssip重组菌，并对pg-gbssip中目的gbssip测序，正确gbssip序列在genbank注册基因ay948720。
重组gbssip:glgc获得
lb液体培养基分别培养含有pg-gbssip和pc-0380的大肠杆菌，分别提取pg-gbssip和pc-0380质粒，ncoi/psti分别酶切将质粒，纯化回收gbssip和pc-0380；按照t4dna连接酶(takara公司d2011a)说明书的方法，建立连接反应，将gbssip连接于pc-0380多克隆位点ncoi和psti间；按照《分子克隆实验指南》p237-259的方法，hindiii和bamhi酶切鉴定连接是否正确，获得pc-gbssip。ncoi和bglii(takara公司)酶切pg-glgc和pc-gbssip，纯化回收glgcdna片段和pc-gbssip；按照t4dna连接酶(takara公司d2011a)说明书的方法，建立连接反应，将glgc连接于pc-gbssip中的gbssip多下游。hindiii和bamhi分别酶切，得到约1kb和约1.2kb的片段，鉴定连接是否正确；其次扩大培养含pc-pg重组菌，并对pc-pg中目的gbssip:glgc测序，获得序列正确pc-pg，其中包含重组基因gbssip:glgc。
重组基因功能检测
按照visser等的方法，以马铃薯无菌苗直径2-4mm茎段为外植体，用农杆菌介导途径转化目的基因gbssip:glgc于马铃薯体内；pcr阳性转化株系，经过southern杂交(北京美莱博医学科技有限公司,法地高辛标记试剂盒，地高辛杂交检测试剂盒)获得单拷贝插入株系，rt-pcr和northern杂交(北京美莱博医学科技有限公司,法地高辛标记试剂盒，地高辛杂交检测试剂盒)鉴定目的基因是否转录，用yao等的方法测定agpase活力，用淀粉测试盒(bioassay公司，enzychromstarchassaykit)测定块茎淀粉含量，块茎直链淀粉含量按照hovenkamp-hermelink等的方法进行；充分洗净且干燥的淀粉，制成4％(w/v)悬浮液,依据3mm(上海申谊玻璃制品有限公司)毛细管粘度计法测定淀粉粘度。
通过pcr等方法，在体外条件下通过点突变实现本发明所用glgc55编码蛋白质中的4个突变，获得glgc55同样的dna序列；另外，本发明中glgc与gbssi启动子的酶切连接可通过pcr途径实现，而不需要内切酶和连接酶，也可获得重组基因gbssip:glgc。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110>南京固山生物技术有限公司
<120>一种植物淀粉品质改良重组基因gbssip:glgc及其应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2324
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
ctgcagtgtatcaattttgtaatagaaccatgcatctcaatcttaatactaaaaaatgca60
acaaaattctagtggagggaccagtaccagtacattagatattattttttattactataa120
taataatttaattaacacgagacataggaatgtcaagtggtagcggtaggagggagttgg180
tttagctttttagatactaggagacagaaccggaggggcccattgcaaggcccaagttga240
agtccagccgtgaatcaacaaagagagggcccacaatactgtcgatgagcatttccctat300
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