本发明属于基因工程技术领域，涉及到一种基于crispr-cas9特异性靶向敲除人smyd3基因的方法，以及用于特异性靶向smyd3基因的sgrna。
背景技术：
crispr/cas系统最早发现于细菌的天然免疫系统内，其主要功能是对抗入侵病毒及外源dna。crispr/cas系统作为基因体的剪辑工具，与talen和zfn技术并称为现代基因工程技术的三大基因编辑技术。
crispr系统包含ⅰ、ⅱ和ⅲ型三种不同的类型，其中ⅱ型crispr-cas9系统应用最为广泛。其原理为crispr序列转录rna(crrnas)与反式激活rna(tracrrna)结合，形成成熟的crrna-tracrrna，引导cas9核酸内切酶到靶序列上，并在pam位点上游3bp处特异性剪切dna双链，形成dsb(doublestrandbreak)。dna双链断裂后主要通过两种途径被修复，一是同源重组修复，一是非同源末端连接。cas9核酸内切酶作用于dna双链产生dsb，可通过非同源末端连接进行修复，产生碱基的插入或缺失，造成移码突变，从而破坏基因；也可能突变造成终止密码子，过早终止蛋白的合成。
smyd3(setandmynddomaincontaining3)是发现于2004年的一种组蛋白甲基转移酶，可以通过使染色体组蛋白h3-赖氨酸4(h3k4)形成二甲基化或三甲基化，从而造成染色体空间结构的异常改变，并进而影响下游许多癌基因、细胞周期调控基因、信号转导相关基因等的表达，最终导致细胞增殖速度加快。人smyd3基因位于人染色体lq44，共有12个外显子，由428个蛋白质组成。smyd3编码的蛋白折叠成两叶结构，形成五个结构域，其中重要的两个功能结构域为位于n端第201-239位氨基酸的setdomin和第49-87位氨基酸的zf-mynd结构域。setdomin具有甲基化转移酶功能，可以特异性的使染色体组蛋白h3k4形成二甲基化或三甲基化，从而使染色体空间结构变得松散。
smyd3基因在很大程度上是一种胞质赖氨酸甲基转移酶，在肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌等许多癌细胞中高度表达，而在正常组织中表达量相对较低，表明smyd3的高度表达与肿瘤的发生发展有着密切的关系。
近年来，随着基因编辑技术的进步，在基因水平治疗肿瘤有了很大的希望。有研究表明，smyd3在肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡方面起着很大的作用，可以作为肿瘤治疗的靶点，为今后临床治疗肿瘤提供了新的思路。
技术实现要素：
本发明的目的是构建一种crispr-cas9靶向敲除人smyd3基因的方法，以及用于特异性靶向人smyd3基因的sgrna，以制备得到smyd3基因敲除的细胞模型。
本发明首先提供了一种特异性靶向人smyd3基因的sgrna，所述sgrna在人smyd3基因上的靶位点位于所述基因的第二个外显子区域，且靶序列唯一。具体地，所述sgrna含有seqidno.1所示的核苷酸序列。
本发明上述sgrna针对的人smyd3基因的靶位点序列如seqidno.2所示。
接着，本发明提供了一种用于靶向敲除人smyd3基因的crispr-cas9系统，在所述系统中含有cas9蛋白和上述特异性靶向人smyd3基因的sgrna，或者含有携带有编码cas9蛋白的编码序列和编码sgrna的编码序列。
优选地，所述crispr-cas9系统中，所述cas9蛋白的编码序列与sgrna的编码序列位于同一质粒载体上。
更优选地，所述的质粒载体为px459质粒。
进而，本发明提供了一种crispr-cas9靶向敲除人smyd3基因的方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括下述步骤：
1)构建特异性靶向人smyd3基因的sgrna，所述sgrna含有seqidno.1所示的核苷酸序列，在人smyd3基因上的靶位点位于基因的第二个外显子区域，靶序列唯一；
2)根据所述sgrna合成1对互补的寡聚核苷酸，磷酸化、退火后形成双链sgrna寡聚核苷酸；
3)bbsi酶切质粒载体px459，使其线性化，与所述双链sgrna寡聚核苷酸连接，构建真核表达载体px459-sgrna；
4)以px459-sgrna质粒转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布含有ampicillin的lb固体培养板，挑选单克隆，于含有ampicillin的lb液体培养基中培养，提取无内毒素的px459-sgrna质粒；
5)以lipofectamine®2000脂质体包裹px459-sgrna质粒，转染目标细胞，构建smdy3基因敲除的细胞模型。
本发明所构建的用于靶向敲除人smyd3基因的crispr-cas9系统可应用于制备smyd3基因敲除的细胞模型，以为进一步研究smyd3基因的功能及其有关通路提供便利。
具体地，本发明应用所构建的crispr-cas9系统，敲除了人bel-7402肝癌细胞的smyd3基因，并经过筛选挑取单克隆细胞，方便快捷的构建得到了smyd3基因敲除的人bel-7402肝癌细胞单克隆细胞系。
更进一步地，本发明所构建的crispr-cas9系统可以应用于制备用于预防和/或治疗肿瘤细胞的药物。
更具体地，本发明所构建的crispr-cas9系统可以应用于制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物；可以应用于制备用于抑制肿瘤细胞迁移、侵袭的药物；可以应用于制备用于促进肿瘤细胞凋亡的药物。
本发明构建的crispr-cas9系统能够快速、简便、高效、特异性的靶向敲除人smyd3基因，为实现肿瘤的免疫治疗提供了一种可行的策略，可以有力的推动基因技术在肿瘤治疗方面的进展。
附图说明
图1是smdy3基因敲除的bel-7402细胞模型的pcr扩增产物电泳图。
图2是westernblot检测smyd3蛋白的表达。
图3是smdy3基因敲除的bel-7402细胞模型的迁移能力图。
图4是smdy3基因敲除的bel-7402细胞模型的增殖能力图。
具体实施方式
下述实施例仅为本发明的优选技术方案，并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中，若未特别指明，实验中未注明的具体实验方法，均按照常规条件或说明书进行操作，所用试剂均为市售商品试剂。
实施例1：靶向人smyd3基因位点的sgrna的设计与合成。
根据genebank中人smyd3的基因序列，在人smyd3基因的第二个外显子区域设计潜在的靶点。通过在线设计工具(http://crispr.mit.edu/)及sgrna设计原则，设计并评估获得了一条dna序列如seqidno.1所示的sgrna。
该sgrna针对的人smyd3基因上的靶序列位于基因的第二个外显子区域，靶序列唯一，核苷酸序列为cactacagtatttggcgacg。
实施例2：靶向人smyd3基因位点的sgrna寡核苷酸的合成和构建。
根据实施例1设计好的sgrna，在其5’端连接上g和cacc粘性末端，得到下述正向寡核苷酸(forwardoligo)：5’-caccgcactacagtatttggcgacg-3’。
根据所设计的sgrna序列，获得其互补链，并在5’端连接aaac，3’端连接c，得到下述反向寡核苷酸(reverseoligo)：5’-aaaccgtcgccaaatactgtagtgc-3’。
上述设计好的sgrna寡核苷酸序列送生物公司合成。将合成出的人smyd3基因靶位点序列对应的两寡核苷酸序列forwardoligo和reverseoligo成对磷酸化、退火，形成磷酸化修饰的、带有粘性末端的短双链sgrna寡聚核苷酸。
反应体系如下：蒸馏水重悬sgrna到终浓度100µm，取forwardoligo1µl，reverseoligo1µl，10×t4ligationbuffer1µl，t4pnk0.5µl，以ddh2o补足至10µl。
将上述反应体系在200µlpcr管中混合均匀，放入pcr仪中，37℃孵育30min，95℃变性5min，然后以每分钟5℃的速率降温至25℃，完成反应，获得可以连入px459真核表达载体的双链sgrna寡聚核苷酸。
实施例3：真核表达质粒的构建。
取真核表达载体pspcas9(bb)-2a-puro(px459)，以bbsi酶切使其线性化，37℃水浴30min后，1%琼脂糖凝胶电泳，以omege胶回收试剂盒(货号d2500-01)回收凝胶产物。
具体酶切体系如下：px4591µg，fastdigestbbsi1µl，fastap1µl，10×fastdigestbuffer2µl，以ddh2o补足至20µl。
将上述线性化的px459与实施例2制备的双链sgrna寡聚核苷酸进行连接，反应体系如下：线性化px45950ng，退火产物(1∶99稀释)1µl，2×quickligationbuffer5µl，quickligase1µl，以ddh2o补足至10µl。
将上述反应体系于室温孵育10min，将所述双链sgrna寡聚核苷酸与线性化的px459片段连接后，获得真核表达质粒px459-sgrna。
以所述px459-sgrna质粒转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布于含有100µg/mlampicillin的lb固体培养板上，过夜培养。挑选单克隆，于5ml含100µg/mlampicillin的lb液体培养基，37℃培养12～16h。
以sgrna为上游引物，5’-aaaaaagcaccgactcggtgccac-3’为下游引物，菌液为模板，pcr验证阳性菌落。
pcr反应体系如下：模板1µl，pcrmixtaq10µl，上游引物1µl，下游引物1µl，以ddh2o补足至20µl。
pcr扩增程序如下：94℃10min，94℃30s，58℃30s，72℃30s，4℃59min，共30个循环。
以u6为引物，经测序验证，所述短双链sgrna寡聚核苷酸已经准确连入真核表达载体px459中。提取得到px459-sgrna质粒。
实施例4：无内毒素真核表达质粒的制备。
取px459-sgrna质粒1ng，加入50µl大肠杆菌dh5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热激45s，冰上放置2min，加入500µllb液体培养基，37℃培养1h。10000rpm离心1min，倒掉大部分上清液，剩余培养基重悬感受态细胞，涂布于含有100µg/mlampicillin的lb固体培养板，过夜培养。
取单克隆菌落于5ml含有100µg/mlampicillin的lb液体培养基，37℃培养12～16h。
收集菌液，4℃，10000rpm离心，收集菌体，以omegaplasmiddnaminikit试剂盒提取得到无内毒素的px459-sgrna质粒。
实施例5：脂质体转染bel-7402细胞构建smdy3基因敲除细胞模型。
复苏bel-7402细胞，将细胞放入完全培养基培养瓶中，于37℃，5%co2培养箱中培养。
转染前一天，将细胞接种于六孔板中，第二天观察细胞密度，达到70～80%时即可进行转染。
将六孔板中的培养基弃掉，pbs缓冲液冲洗两遍，每孔加1ml不含血清和青链霉素的rpmi-1640培养基。取6µgpx459-sgrna，18µllipofectamine®2000，分别与600µlopti-mem培养基混匀，室温孵育5min。孵育完成后，将lipofectamine®2000与px459-sgrna混匀，室温孵育20min，加入到六孔板中，每孔加200µl混合液。4～6h后更换含10%胎牛血清的rpmi-1640培养基。
转染后24～48h，换含有11mg/mlpuromycin的完全培养基，筛选4～5天。
筛选完成后，利用胰酶消化仍贴壁的细胞，1000rpm离心，收集细胞，加1ml完全培养基重悬，取一部分提取dna，剩余细胞种回培养瓶。
以提取的dna为模板，扩增靶位点序列。
上游引物：5’-tggaaggttcaagaggaggct-3’。
下游引物：5’-cctggcaacctgtgtgactc-3’。
pcr反应体系如下：dna模板1µl，pcrmixtaq10µl，上游引物1µl，下游引物1µl，以ddh2o补足至20µl。
pcr扩增程序如下：94℃10min，94℃30s，58℃30s，72℃30s，4℃59min，共30个循环。
以pcr产物连接peasy®-t1，pcr产物1µl，peasy®-t1simpleclonevector1µl，室温连接5min。
连接产物中加入50µl感受态细胞trans1-t1，混匀，冰浴30min，42℃热激30s，冰上放置2min，加入500µllb液体培养基，37℃培养1h。取菌液100µl，涂布于lb固体培养基，37℃过夜培养。
挑取三个单菌落，分别加入5mllb液体培养基(含5µlamp)，37℃培养12h。取1µl菌液，以m13f为上游引物，m13r为下游引物进行pcr扩增。扩增结果如图1所示，证明pcr产物已经被连入peasy®-t1载体中，可用于基因测序。
取阳性菌液进行测序，测序引物srprimer。
测序结果如seqidno.3所示，与seqidno.2所示的sgrna针对的人smyd3基因靶序列比较，显示sgrna靶位点的序列发生了移码突变。证明基因敲除成功，本发明特异性靶向敲除人smyd3基因的方法能建立稳定可靠的smyd3基因敲除细胞模型。
实施例6：westernblot检测smyd3敲除效果。
按照实施例5方法，分别以px459-sgrna质粒和px459质粒转染bel-7402细胞。转染后24～48h，每孔加入2ml含有11mg/mlpuromycin的完全培养基，puromycin筛选3～4天后，提取细胞蛋白。
同时取不做任何处理的bel-7402细胞，待培养长至80%左右，提取细胞蛋白质。
弃去六孔板中培养基，pbs清洗两遍，加入200µl蛋白裂解液(ripa∶pmsf=100∶1)，冰上裂解30min。
吹打六孔板底部，将裂解反应物吸入离心管中。13000rpm离心10min，吸取上清，转移至新的离心管中。
沸水浴煮沸蛋白质5min，使蛋白质变性，于-20℃冰箱保存。
以bca法测定蛋白样品的浓度，其中，bel-7402细胞蛋白浓度4.74µg/µl，转染px459的bel-7402细胞蛋白浓度6.58µg/µl，转染px459-sgrna的bel-7402细胞蛋白浓度4.48µg/µl。
电泳装置中装入分离胶和浓缩胶，取样品蛋白和适量上样缓冲液，涡旋混匀，煮沸5min后，点样于电泳孔中，同时于边缘孔中点3µlmaker，100v电泳至溴酚蓝在分离胶中压成一条直线，然后以120v电泳至溴酚蓝到达电泳槽底部。
恒流转膜(电流大小为膜面积×1.5ma)，转膜时间100min。
配制5%蛋白封闭液，转膜结束后将膜放于封闭液中，摇床上低速摇动1h。
以pbst稀释smyd3一抗和gapdh一抗(1∶1000)，将膜放于一抗液中，4℃冰箱中摇床过夜。pbst洗膜3次，每次10min。
以pbst稀释相应二抗(1∶5000)，将膜放于其中，室温孵育1h。pbst洗膜3次，每次5min。
显影，结果如图2。从图中可以看出，与不做任何处理的bel-7402细胞(野生型细胞)和px459质粒处理的bel-7402细胞相比，以px459-sgrna质粒处理的bel-7402细胞(基因缺陷型细胞)的smyd3蛋白表达明显下降。
实施例7：细胞划痕实验检测细胞迁移。
分别将野生型bel-7402细胞和基因缺陷的px459-sgrna-bel-7402细胞接种于六孔板中，观察细胞生长状况，当细胞密度为80%左右时，用200µl枪头比着直尺在六孔板中画直线，用pbs轻柔冲洗两遍，去除漂浮细胞，加入无血清培养基，37℃，5%co2细胞培养箱中培养，0h、24h、48h时拍照记录，测量细胞生长边缘距离中点的距离。
测量结果如图3。结果表明smyd3基因缺陷的bel-7402细胞株比野生型bel-7402细胞株的迁移能力弱。差异具有统计学意义(p<0.05)。
实施例8：cck-8实验检测细胞增殖。
收集野生型bel-7402细胞和基因缺陷的px459-sgrna-bel-7402细胞，计数后，按每孔1000个细胞，将细胞接种于96孔板，周围用pbs填充。将96孔板放入37℃，5%co2细胞培养箱中培养，每隔24h进行cck-8实验，每孔加入10µlcck-8溶液，37℃细胞培养箱孵育4h，用酶标仪在450nm下测量每孔的吸光度值，绘制细胞生长曲线。
cck-8实验结果表明，在培养72h后，smyd3基因缺陷的bel-7402细胞株比野生型bel-7402细胞株的增殖能力下降，差异具有统计学意义(p<0.05)。
sequencelisting
<110>山西医科大学
<120>crispr-cas9靶向敲除人smyd3基因的方法及其特异性sgrna
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<212>dna
<213>人工序列
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<223>smyd3基因第二外显子的sgrna
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<223>野生型smyd3基因序列(152095-152444)
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ttcttaatgcagaattaatttttttccccacaggaaggaaaagctgatgcgatgctctca180
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<223>突变型smyd3基因序列(152095-152444)
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