一种牛瘤胃微生物纤维素酶eg基因在乳酸菌表达中的应用

本发明属于生物工程
技术领域：
，具体涉及一种牛瘤胃微生物纤维素酶eg基因在乳酸菌表达中的应用。
背景技术：
：纤维素酶是一类将纤维素降解为单糖的一种复合酶系，主要作用于纤维素的β-d-1-4葡萄糖苷键，将纤维素降解为纤维二糖、葡萄糖等物质，根据其作用部位的差别，主要包括：1)内切葡聚糖酶(endoglucanase，eg)，即内切1,4-β-d-葡聚糖-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-d-glucanase，ec3.2.1.4)，也称为cx酶；2)外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase，cbh)，即外切β-1,4-d-葡聚糖-纤维二糖水解酶(exo-b-1,4-d-glucanase，ec3.2.1.91)；3)β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，bg)，即β-d-葡葡糖苷酶(β-d-glucosidase，ec3.2.1.21)。正是通过这3种酶的共同配合，将纤维素物质降解为单糖等，它们缺一不可。内切葡聚糖酶，主要对纤维素的β-d-1,4葡萄糖苷键发挥作用，使β-d-1,4葡萄糖苷键断裂，产生大量短链纤维素分子及寡糖，还有一些纤维素分子带非还原性末端。外切β-1,4葡聚糖酶主要作用于内切葡聚糖酶水解产物带非还原性末端的纤维素小分子和还原性末端，通过水解纤维素的β-d-1,4葡萄糖苷键，产生纤维二糖分子。这种二糖和其它纤维寡糖的进一步水解由β葡萄糖苷酶作用降解为葡萄糖。秸秆青贮使青贮料得以长期保存，还可增加饲料的适口性，并且基本不影响饲料的纤维素，维生素和蛋白质等的含量。但植物秸秆细胞壁含有40％～50％纤维素，在青贮过程中含量基本不变，需经过纤维素酶的作用水解成单糖才有利于动物吸收利用，同时破坏了植物的细胞壁还可以释放出原生质中的营养成分，增加饲料的利用率和动物的生产性能。研究也发现纤维素酶添加到饲料可补充草食动物内源酶的不足，有消除抗营养因子的作用，可以提高畜禽生产性能，降低致病微生物的黏附和定植等功能。因此，通过基因工程的方法将纤维素酶基因共表达载体导入乳酸菌中构建分泌型表达菌株，乳酸菌分泌型表达载体的成功构建可实现外源基因的分泌表达，因此不需再进行酶制剂的发酵生产、纯化和添加过程即可直接加入青贮原料中进行青贮，并在青贮的同时不断的分泌纤维素酶，降解秸秆中的纤维素，产生的单糖又能被乳酸菌所利用，促进青贮，从而可提高青贮饲料品质、营养价值和消化率。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种提高青贮饲料中纤维素利用率，提高青贮饲料品质、营养价值和消化率的牛瘤胃微生物纤维素酶eg基因在乳酸菌表达中的应用。为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种牛瘤胃微生物纤维素酶cbh基因与eg基因在乳酸菌共表达中的应用，包括如下步骤：1)提取牛瘤胃混合微生物总dna；2)以总dna为模板扩增得到cbh基因与eg基因片段，将其与乳酸菌信号肽usp45一同整合至表达载体pmg36e中，构建出分泌型表达载体pmg36e::eg::cbh；3)将测序正确后的重组质粒电转导入乳酸如球菌l.lactisnz9000，得pmg36e::eg::cbh/l.lactisnz9000重组菌株。进一步地，所述牛瘤胃微生物纤维素酶基因由烟曲霉纤维二糖水解酶cbh基因与多粘类芽孢杆菌杆菌内切-β-1,4-葡聚糖酶基因共同组成。进一步地，所述乳酸菌受体菌为乳酸乳球菌l.lactisnz9000。所述的一种牛瘤胃微生物纤维素酶cbh基因与eg基因在乳酸菌共表达中的应用，采用以下方式实现：1)将烟曲霉纤维二糖水解酶cbh基因与多粘类芽孢杆菌杆菌eg基因进行重组，得重组乳酸菌菌株；2)分别以滤纸、再生无定型纤维素与cmc-na为底物，使用dns法测定总酶活，外切酶酶活以及内切酶酶活；3)以重组菌液上清为粗酶测定重组酶的底物特异性，最适ph与温度，以及金属离子与化学试剂对酶活的影响。进一步地，所述步骤1)中重组乳酸菌菌株将重组纤维素酶分泌到胞外，在48-65kda之间有两个条带。进一步地，所述步骤2)中滤纸酶活为7.2956±1.5241u/ml，重组菌液上清沉淀蛋白的外切酶酶活为13.0266±0.2514u/ml，内切酶酶活为14.7655±0.1017u/ml。进一步地，所述步骤3)中底物特异性大小顺序为微晶纤维素>再生无定型纤维素>cmc-na>脱脂棉>滤纸。进一步地，所述步骤3)中最适ph与温度分别为ph＝6与80℃。所述烟曲霉纤维二糖水解酶cbh基因，genebank编号为xm_745951.1，多粘类芽孢杆菌杆菌eg基因，genebank编号ab_695293.1。1mm的fe2+、ba2+对重组乳酸菌纤维素酶有促进作用；而1mm的mn2+、cu2+几乎对酶活无影响；同时1mm的zn2+、mg2+、ca2+、hg2+、co2+、k+、mg2+、edta以及1％的吐温20对酶活有抑制作用。5mm的mn2+、fe2+、ba2+、ca2+、cu2+、co2+、mg2+以及10％的吐温20对酶活有促进作用；5mm的zn2+、hg2+、k+、edta对酶活有抑制作用。与现有技术相比，本发明的有益效果是：1)本发明根据ncbi下载的纤维素酶cbh基因与eg基因序列，设计多对引物，以牛瘤胃的全基因组为模板分别扩增出两条大小为1500bp左右的目的条带；将其连同乳酸菌信号肽usp45一同克隆至表达载体pmg36e中获得分泌型表达载体pmg36e::eg::cbh；分别用sacⅰ和xbaⅰ，xbaⅰ和pstⅰ内切酶双酶切重组质粒，同时使用sacⅰ单酶切重组质粒与pmg36e空质粒加以验证，重组质粒切出两条大小约为1500bp的条带，并将该质粒送至金唯智公司测序后，结果表明该pmg36e::eg::cbh重组质粒构建成功。2)本发明采用10％tca/丙酮沉淀浓缩上清中的蛋白，并将pmg36e::eg::cbh/l.lactisnz9000菌液，上清、沉淀及pmg36e空质粒的菌液，上清和沉淀分别制样进行sds-page分析，结果表明浓缩后的蛋白在48-65kda之间有两条带，表明有目的蛋白的表达。3)本发明分别将pmg36e::eg::cbh/l.lactisnz9000的菌液，上清、沉淀及浓缩蛋白和pmg36e/nz9000菌液，上清、沉淀作为阴性对照，用生理盐水作为空白对照分别加入cmc-na/gm17与微晶纤维素/gm17固体培养基30℃孵育反应后。pmg36e::eg::cbh/l.lactisnz9000上清、pmg36e::eg::cbh/l.lactisnz9000浓缩后的蛋白以及pmg36e::eg::cbh/l.lactisnz9000菌液出现明显的水解圈，且浓缩后的水解圈直径大于pmg36e::eg::cbh/l.lactisnz9000上清的水解圈直径，表明该酶具有一定的酶活力。4)本发明克隆了牛瘤胃微生物的的纤维二糖水解酶基因cbh与内切-β-1,4-葡聚糖酶基因，将其连同乳酸菌信号肽usp45一同克隆至表达载体pmg36e中获得分泌型表达载体pmg36e::eg::cbh，使用dns法测定总酶活，外切酶酶活以及内切酶酶活发现，滤纸酶活为7.2956±1.5241u/ml，重组菌液上清沉淀蛋白的外切酶酶活为13.0266±0.2514u/ml，内切酶酶活为14.7655±0.1017u/ml。附图说明图1为本发明重组质粒结构示意图；图2为本发明牛瘤胃微生物纤维素酶eg基因与cbh基因遗传聚类分析；图3为本发明牛瘤胃微生物纤维素酶eg基因与cbh基因扩增及重组质粒酶切验证；图4为本发明中重组菌株蛋白表达sds-page电泳图；图5为本发明中重组菌株以cmc-na为底物刚果红水解圈和以微晶纤维素为底物刚果红染色水解圈；图6为本发明中酶学性质分析。其中，图1中红色代表插入的牛瘤胃微生物纤维素酶cbh基因，绿色代表eg基因；图2中发现牛瘤胃微生物纤维素酶cbh基因与烟曲霉纤维二糖水解酶基因聚为一支，eg基因与多粘类芽孢杆菌内切-β-1,4-葡聚糖酶基因聚为一支；图3中m10000:10000bp的dnamarker；m5000:5000bp的dnamarker；1:牛瘤胃微生物纤维素酶cbh基因扩增；2:牛瘤胃微生物纤维素酶eg基因扩增；3：pmg36e质粒单酶切；4：重组质粒单酶切；5：重组质粒sacⅰ与xbaⅰ双酶切；6：重组质粒xbaⅰ与pstⅰ双酶切；图4中m:蛋白marker；1：pmg36e/nz9000菌液；2:pmg36e/nz9000上清；3：pmg36e/nz9000沉淀；4:pmg36e::eg::cbh/nz9000菌液；6:pmg36e::eg::cbh/nz9000上清；7:pmg36e::eg::cbh/nz9000浓缩蛋白；8：0.1g/ml的纤维素酶标准品。图5中1：pmg36e/nz9000沉淀；2：pmg36e/nz9000菌液；3：pmg36e/nz9000上清；4：pmg36e::eg::cbh/nz9000菌液；5：pmg36e::eg::cbh/nz9000上清pmg36e::eg::cbh/nz9000沉淀；7：pmg36e::eg::cbh/nz9000浓缩蛋白；8：0.1g/ml的纤维素酶标准品。图6中图a、b、c、d依次为不同底物，不同金属离子以及和化学试剂，不同ph值，不同温度对重组酶酶活的影响。具体实施方式下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下面对本发明的一种牛瘤胃微生物纤维素酶eg基因在乳酸菌表达中的应用做进一步具体说明。一、材料与方法1、试验材料1)菌种与载体：具体为瘤胃液、乳酸菌(l.lactis)nz9000、e.colijm109、载体pmg36e。2)培养基配制：lb液体培养基：胰蛋白胨tryptone1g酵母提取物yeastextract0.5g氯化钠nacl1g加水至100ml，121℃高压灭菌30min。lb固体培养基：在100ml的lb液体培养基中加入1.6g琼脂，121℃高压灭菌20min。gm17液体培养基(红霉素抗性)：加水至100ml，ph7.1，115℃高压灭菌20min。(vc母液配制：5g维生素c固体粉末加100ml蒸馏水,用0.45μm的细菌滤器过滤；0.025g/ml红霉素母液配制：0.125g红霉素溶于50ml无水乙醇)gm17固体培养基：在100ml的gm17液体培养基中加入1.5g琼脂，115℃高压灭菌20min。cmc-na/gm17固体培养基(用于刚果红染色)：在100ml的gm17固体培养基加入1gcmc-na，边加热边搅拌，待cmc-na溶解后，115℃高压灭菌20min；微晶纤维素/gm17固体培养基：在100ml的gm17固体培养基加入1g微晶纤维素，边加热边搅拌，搅拌均匀后，15℃高压灭菌20min。3)主要试剂及仪器：4)试剂配制10％(w/v)tca/丙酮：10gtca(三氯乙酸)溶于100ml丙酮中，-20℃保存；溶菌酶缓冲液：0.3mol/l蔗糖，25mmol/ltris-hcl(ph8.0)，25mmol/ledta(ph8.0)。2×sds上样缓冲液：sds4g、溴酚蓝0.2g、甘油20ml、1.0mol/ltris-hcl10ml、β-巯基乙醇10ml，加蒸馏水至100ml。tris-甘氨酸电泳缓冲液：称取3.02gtris，18.8g甘氨酸，1gsds置于1l烧杯，搅拌溶解，加蒸馏水定容至1000ml。elutionbuffer：500mmol/lnacl，20mmol/ltris-hcl，250mmol/l咪唑，ph为8.9。10％sds:称取1gsds溶于10mlddh2o。1.0mol/ltris-hcl缓冲液:称取6.6gtris，加蒸馏水40ml，用浓盐酸调ph＝6.8，再加蒸馏水至50ml。1.5mol/ltris-hcl缓冲液:称取9.08gtris，加蒸馏水40ml，用浓盐酸调ph＝8.8，再加蒸馏水至50ml.刚果红染色液：称取0.1g刚果红溶于10mlddh2o，置4℃备用100mmol/lcacl2溶液：1.109gcacl2加蒸馏水定容至100ml，121℃高压灭菌30min后4℃保存。15％甘油cacl2溶液：2ml甘油中+8ml100mmol/lcacl2溶液，121℃高压灭菌30min后4℃保存。溶液a：10％甘油，0.5mol/l蔗糖，115℃高压灭菌20min。溶液b：0.05mol/letda，0.5mol/l蔗糖，10％甘油，115℃高压灭菌20min。1％(w/v)羧甲基纤维素悬浮液：1g羧甲基纤维素溶于100ml水中，混匀，放4℃冰箱备用。0.1m醋酸钠缓冲液：将购买的3m醋酸钠缓冲液稀释30倍，用醋酸和naoh调节ph,放4℃冰箱备用。2％(w/v)羧甲基纤维素悬浮液：2g羧甲基纤维素溶于100ml醋酸钠缓冲液中，混匀，放4℃冰箱备用。2％(w/v)微晶纤维素悬浮液：2g微晶纤维素溶于100ml醋酸钠缓冲液中，混匀，放4℃冰箱备用。再生无定型纤维素(rac)的制备：a.称取0.2g微晶纤维素置于50ml离心管中，加入600μl0℃无菌水，搅拌均匀成浆状物；b.量取10ml85％的0℃预冷磷酸，先缓慢加入8ml，边加入边快速搅拌，充分混匀后再加入余下2ml，充分搅拌使微晶纤维素完全溶解，几分钟后溶液变透明；c.冰上放置1h，期间适时搅拌；d.加入40ml0℃无菌水，每次加入10ml，充分搅拌，得到白色沉淀。4℃，5,000×g离心20min，弃上清，沉淀用预冷无菌水冲洗4次去除残留磷酸；e.沉淀中加入2mol/l的na2co3溶液200μl中和残余的磷酸，而后加入45ml预冷无菌水离心弃上清，反复洗涤沉淀直至ph为5-7；f.将得到的沉淀稀释至1％，4℃保存备用。2、实验方法1)设计引物:(下滑单线为saci识别位点)；eg-r:gctctagactaatttggttctgttcccca-3′(下滑单线为xbai识别位点)(下划单线为xbaⅰ识别序列)；cbh-r：aactgcagtacaggcactgagagtaata；(下划单线为pstⅰ识别序列)；其中，下滑双线为核糖体结合位点，下滑波浪线为乳酸菌信号肽usp45序列。2)所述基因组的提取通过改进的ctab法提取牛瘤胃总dna，电泳检测，具体包括如下步骤：取50ml解冻的瘤胃液,1000r/min离心10min弃去沉淀,12000r/min离心10min弃去上清液,用5mlte缓冲液悬浮沉淀。取上述处理的瘤胃微生物样品1ml,加入dna抽提液5ml(100mmol/ltris-hcl,50mmol/ledta,2％十二烷基肌氨酸),在振荡器上充分混匀；加入100μ`l2mg/ml蛋白酶k,液氮中速冻5min,然后65℃水浴保温10min,重复3次；再加入1/5体积的20％sds,65℃温浴10min,室温静止5min,离心收集上清液,向上清液中加入nacl溶液至终浓度1mol/l,ctab至1％,65℃温浴10min,置于冰上加入等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿各抽提一次和两次,加入1/10体积的3mol/l乙酸钠溶液,2倍体积的无水乙醇,冰上放置15min以上；12000r/min离心10min后收集沉淀,最后以75％乙醇洗涤2～3次,干燥,溶解于适量的te缓冲液。3)以瘤胃液基因组为模板，cbh基因扩增条件为：98℃预变性5min；98℃变性30s；60℃复性30s；72℃延伸30s；共30个循环；72℃延伸10min。反应体系如表1，eg基因扩增条件为：94℃预变性5min；94℃30s；56℃30s；72℃90s；共30个循环；72℃延伸10min；pcr反应体系见表2，pcr扩增完毕取pcr产物3μl，通过1％琼脂糖凝胶进行检测，观察片段大小。用dna凝胶回收试剂盒进行纯化回收；表1cbh基因的pcr反应体系(50μl)template1μlp12.5μlp22.5μltaq酶25μlddh2o19μl总量50μl表2eg基因的pcr反应体系(50μl)4)pmg36e质粒的提取：取pmg36e的e.colitop10单菌落，在3ml终浓度为600μg/ml(红霉素)的lb液体培养基中培养过夜。12000r/min离心1min，收集菌体质粒提取试剂盒提取。取提取的质粒3μl，通过1％的琼脂糖凝胶进行检测。5)目的基因与空质粒的双酶切：将扩增基因与质粒pmg36e同时经和进行双酶切，37℃酶切3h，双酶切体系见表2，取4μl酶切产物通过1％的琼脂糖凝胶进行检测(酶切前的一起检测进行对比)。表3cbh与pmg36e双酶切反应体系(50μl)cbh/pmg36e30μlxbaⅰ3μlpstⅰ3μl10×kbuffer5μlddh2o9μl总量50μl6)酶切产物的纯化切取琼脂糖凝胶中双酶切后的基因片段、质粒pmg36e，放入干净的1.5ml离心管中，用胶回收试剂盒纯化回收产物，dna与-20℃保存。7)cbh基因与pmg36e的连接将酶切后的cbh基因与pmg36e，经t4连接酶22℃过夜连接，连接反应体系见表3；表4连接反应体系(10μl)pmg36e1.7μlcbh6.3μlt4dnaligase1μl10×ligasebuffer1μl总量10μl8)转化：①将100l大肠杆菌top10加入连接产物中，轻轻混匀后冰浴30min。②42℃热激90s，冰浴3min。③在1.5ml离心管中加入890l的无抗lb液体培养基，37℃振荡培养1h，5000r/min，离心2min。④弃上清，混匀后加入用无菌l棒涂布于含红霉素(600μg/ml)的lb固体培养基上。37℃培养12～16h。9)阳性转化子的鉴定：取1.5ml离心管，都加入红霉素的lb溶液3ml，然后用镊子夹取最小的枪头在过夜的培养皿上挑取12个单菌落，将挑菌的枪头直接丢入离心管中，将12个试管放入37℃,220r/min摇床中过夜培养。将菌液进行pcr鉴定，设置实验组、阴性对照、阳性对照，实验组模板为上述培养好的菌液，阴性对照模板为ddh2o，阳性对照以扩增得到的目的基因为模板为，在表4所示体系所示条件下pcr扩增，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr产物。实验组以cbh-f/r为引物，重组菌液为模板，进行菌液pcr鉴定，反应体系见表，反应条件，取扩增产物3μl，通过1％琼脂糖凝胶进行检测。实验组可扩出目的条带。鉴定正确的进行双酶切鉴定，菌液pcr反应体系如下：表5cbh基因的菌液pcr反应体系(15μl)菌液1μlp10.6μlp20.6μltaq酶7.5μlddh2o4.5μl总量15μl10)pmg36e::cbh的双酶切验证：设置实验组和对照组，对照组为pmg36e空质粒，将重组菌株菌液提取质粒(-20℃保存)后，经xbaⅰ和pstⅰ双酶切验证，双酶切反应体系见表2，37℃酶切13h，4μl酶切产物通过1％琼脂糖凝胶检测，将菌液pcr与双酶切鉴定均为阳性的菌液，提取质粒后取20l送往金唯智生物科技有限公司测序。11)eg与pmg36e::cbh双酶切体系同表3，连接体系同表4，菌液pcr体系同表5；12)pmg36e::eg::cbh的双酶切验证：设置实验组和对照组，对照组为pmg36e空质粒，将重组菌株菌液提取质粒(-20℃保存)后，分别经sacⅰ与xbaⅰ，xbaⅰ和pstⅰ双酶切验证，双酶切反应体系见表3，37℃酶切3h，4μl酶切产物通过1％琼脂糖凝胶检测，将菌液pcr与双酶切鉴定均为阳性的菌液，提取质粒后取20l送往金唯智生物科技有限公司测序。所述重组质粒在l.lactisnz9000中的表达如下：1.乳酸菌感受细胞的制备：-80℃取l.lactisnz9000菌液，固体无抗gm17板子划线30度培养2天。1)挑取l.lactisnz9000单菌落于在5mlgm17液体培养基(无抗)中，30℃静置培养。2)将菌液加入按1：100加入gm17液体培养基中，30℃静置培养。3)检测菌液od600为0.4时，停止培养，将锥形瓶在冰上放置15min。4)冰浴后轻摇锥形瓶，将菌体倒入50ml灭菌的离心管中，4℃，4000r/min离心20min。5)去除上清，将50ml离心管置于冰上，取10ml预冷的溶液a悬浮菌体，充分混匀后，将所有加溶液a至总体积为50ml。6)4℃，6000r/min离心10min，用25ml预冷的溶液b重悬，两管合一后，4℃6000r/min离心10min。7)收集沉淀，冰浴15min，用25ml预冷的溶液a重悬，4℃，6000r/min离心10min收集菌体。8)向离心管中加入4ml冰上预冷的溶液a，重新悬浮沉淀，用灭菌的1.5ml离心管分装，每管100μl，－70℃保存。2.重组质粒电转l.lactisnz9000-70℃取出感受态细胞，冰盒放置15min融化，取10μl测序正确的质粒加入到100μll.lactisnz9000感受态细胞中，轻轻吹打混匀后放到冰上15min，取出后在无菌条件下转移至冰冷的点击杯中，用电击仪点击，电击条件为：1100v，100ω，25μf。电击转化后迅速加入1mlgm17液体培养基(无抗)，冰浴5min，然后将电击杯中的液体全部转移到1.5ml的离心管中，30℃静止培养3h后，将复苏菌液涂在红霉素终浓度为2.5μg/ml的gm17固体培养基中，挑取单菌落，煮沸粗提基因组后采用pcr扩增方法筛选阳性克隆子pcr反应体系及温度参照重组质粒pmg36e::eg::cbh菌液pcr反应体系。3.pmg36e::eg::cbh/nz9000蛋白的浓缩及sds-page分析1)10％tca/丙酮沉淀浓缩蛋白：电转成功的菌液按1∶100加入到100mlgm17培养基中，30℃静止培养36h，将菌液转移到两个干净的50ml离心管中(高压灭菌)，12000r/min离心10min，将上清用预冷的10％tca/丙酮沉淀蛋白质，12000r/min离心10min，然后用预冷的丙酮洗涤沉淀两次，在通风橱中放置30min，晾干彻底去除丙酮，加入1mlelutionbuffer溶解沉淀。2)sds-page电泳：①制胶配方如下：表5制胶配方试剂12％分离胶5％浓缩胶ddh2o3.3ml4.1ml1.5mtris-hcl2.5ml-1.0mtris-hcl-0.75ml30％acr4.0ml1.0ml10％aps0.1ml0.06ml10％sds0.1ml0.06mltemed0.01ml0.01mltotal10ml10ml迅速吹打混匀后，将8ml分离胶加入到两玻璃板中间的缝隙中，再轻轻加入蒸馏水压线，并排出两玻璃板之间的气泡，静置30min后，倾斜观察分离胶是否凝固，待分离胶凝固后，将上层的蒸馏水倒掉，在小烧杯中配制5％浓缩胶，用枪迅速吹打混匀后，将浓缩胶加满两玻璃板之间的缝隙，并排尽玻璃板之间的气泡，插入1.0mm的梳子，静置30min后，观察浓缩胶是否凝固。②处理样品。分别取空质粒的上清，沉淀，菌液，重组菌株的上清，沉淀蛋白和菌液以及纤维素酶标准品分别各1ml与2×sdsloadingbuffer与样品混匀，在沸水中煮沸10min，冷却后12000r/min离心5min，取上清跑胶。③sds-page电泳。首先将配制好的胶在80v电压下进行预电泳30min，电泳后将处理好的诱导前、诱导后及纯化后样品各取30μl加入孔中，先用100v电压电泳，使样品条带跑至分离胶与浓缩胶交界处时，将电压调节为200v，待条带跑至最边沿时，停止电泳。④染色及脱色。将跑好的胶慢慢从玻璃板上取下，放入考马斯亮蓝染色液中染色5h，将染色好的胶取出，用水冲洗后放入脱色液中进行脱色，直至胶上呈现清晰条带。所述酶活性检测如下：1.葡萄糖标准曲线的制作取24支具有刻度试管，每种浓度三个平行，按表6顺序加入以下各种试剂。表6试剂加入顺序依次混匀后沸水浴10min，涡旋混匀，第一个管作为空白对照，分别在紫外分光光度计下(550nm)处测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。2.粗酶液制备将30℃静止培养36h，将菌液转移到两个干净的50ml离心管中，12000r/mi离心10min，收集上清作为粗酶液；3.刚果红染色法测定酶活力采用刚果红染色法测定内切葡聚糖酶的酶活力，取粗酶液和浓缩后蛋白30μl加入已打孔的cmc-na/gm17固体培养基与微晶纤维素/gm17固体培养基，在30℃恒温箱中过夜培养后，用1％的刚果红进行染色1h，再用1mol/l的nacl溶液脱色1h，依据水解圈直径的大小粗略判断该酶的水解活性。4.重组纤维素酶酶活性质研究1)重组酶底物特异性的检测以rac、羧甲基纤维素钠(cmc-na)、脱脂棉、微晶纤维素、滤纸、分别为底物，加入1ml的粗酶，于50℃反应30min，用dns法测还原糖的产量，计算重组酶对不同底物的比酶活以表征酶的底物特异性。2)温度对重组酶酶活的影响将1ml重组粗酶与1ml底物微晶纤维素按一定比例混匀，分别于30-90℃下反应30min后，按照dns测定纤维素酶活力，以最高的酶活力为100％，绘制相对酶活力与反应温度的关系曲线。3)ph对重组酶酶活的影响分别选取ph3、4、5、6、7、8、9的醋酸-醋酸钠缓冲液配置微晶纤维素反应底物溶液，每组做三次重复，根据dns法测定纤维素外切葡聚糖酶活，分析不同ph对重组外切酶酶活的影响。4)金属离子与化学试剂对重组酶酶活的影响在确定反应最高酶活的最适温度和最适ph值后，分别在粗酶液与微晶纤维素反应液中加入不同的金属离子与化学试剂，使终反应浓度为1.0mmol/l和5.0mmol/l以及1％与10％的化学试剂，主要测定mn2+、zn2+、fe2+、ba2+、ca2+cu2+、hg2+、co2+、k+、mg2+、edta、吐温20对酶活的影响，室温反应30min，每组做三次重复，反应后加入相同体积的高温高压灭活酶作为对照，用dns法测定酶活，测定金属离子以及化学试剂对酶活的影响。5.重组纤维素酶酶活测定在确定出最适底物，ph，温度后，用最适ph的醋酸-醋酸钠缓冲液配制1％的微晶纤维素，取1ml加入1ml10％tca/丙酮沉淀浓缩蛋白于试管中，80℃反应30min，加入1.5mldns试剂，沸水浴10min后，然后置于冰水中冷却，分别向各试管中加入蒸馏水至25ml，涡旋混匀，以高压高温灭火的酶为空白对照，分别在波长550nm处测定吸光度，记录结果。4.滤纸酶活力(fpa)测定纤维素酶的总酶活力采用滤纸酶活力(fpa)测定纤维素酶的总酶活力，在试管中放入1cm×6cm(50±1mg)的新华滤纸条，依次1ml浓缩后蛋白和最适ph的醋酸-醋酸钠缓冲液1.0ml，然后用塑料纸密封，最适温度水浴30min，取出迅速加入1.5mldns，煮沸10min，冷却后加蒸馏水定容至25ml，od550nm测吸收值。6.酶活计算y＝1000cvx/mv1t式中：y—样品的酶活力(u/ml)c—测试液中葡萄糖含量(mg/ml)v—dns反应后定容的体积(ml)x—反应时粗酶液的稀释倍数m—葡萄糖的分子量v1—稀释后吸取的用于催化反应降解纤维素的粗酶液体积(ml)t—水解反应时间(min)用excel软件根据所测得的数据得到回归方程：y＝0.9709x+0.0289，r2＝0.997，获得了良好的标准曲线线性关系。刚果红染色结果发现不能使用cmc-na为底物有明显的水解圈，使用微晶纤维素为底物没有水解圈。以重组菌液上清为粗酶测定重组酶的底物特异性，最适ph与温度，以及金属离子与化学试剂对酶活的影响。发现对微晶纤维素、滤纸、脱脂棉、cmc-na以及再生无定型纤维素(rac)都有活性，底物特异性大小顺序为微晶纤维素>rac>cmc-na>脱脂棉>滤纸；最适ph与温度分别为ph＝6与80℃。1mm的fe2+、ba2+对重组乳酸菌纤维素酶有促进作用；而1mm的mn2+、cu2+几乎对酶活无影响；同时1mm的zn2+、mg2+、ca2+、hg2+、co2+、k+、mg2+、edta以及1％的吐温20对酶活有抑制作用。5mm的mn2+、fe2+、ba2+、ca2+、cu2+、co2+、mg2+以及10％的吐温20对酶活有促进作用；5mm的zn2+、hg2+、k+、edta对酶活有抑制作用。重组酶滤纸酶活为7.2956±1.5241u/ml，重组菌液上清沉淀的蛋白酶外切酶酶活为13.0266±0.2514u/ml，内切酶酶活为14.7655±0.1017u/ml。由以上实验结果可知：本发明根据ncbi下载的纤维素酶eg基因cbh基因序列，设计引物，以牛瘤胃的全基因组为模板分别扩增出两条大小约为1500bp的目的条带；分别用sacⅰ与xbaⅰ，xbaⅰ与pstⅰ内切酶同时酶切重组质粒pmg36e::eg::cbh和pmg36e空质粒，重组质粒切出两条大小约为1500bp的条带，并将该质粒送至金唯智公司测序后，结果表明该pmg36e::eg::cbh重组质粒构建成功。本发明采用10％tca/丙酮沉淀浓缩上清中的蛋白，pmg36e::eg::cbh/nz9000菌液，上清、沉淀及pmg36e空质粒的菌液，上清和沉淀分别制样进行sds-page分析，结果表明浓缩后的蛋白在48-65kda之间有两条明显的条带，表明有目的蛋白的表达。本发明分别将pmg36e::eg::cbh/nz9000的菌液，上清、沉淀及浓缩蛋白和pmg36e/nz9000菌液，上清、沉淀作为阴性对照，用ddh2o作为空白对照加入cmc-na/gm17固体培养基与微晶纤维素/gm17固体培养基30℃孵育反应后。刚果红染色结果发现以cmc-na为底物有水解圈，使用微晶纤维素为底物没有水解圈。并且确定了重组酶的最适底物，ph,温度，以及不同浓度的金属离子与化学试剂对其酶活的影响。本发明克隆了牛瘤胃的纤维素酶eg与cbh基因，成功构建出分泌型表达质粒pmg36e::eg::cbh/nz900。最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12