专利名称:双基因共表达质粒、构建方法和应用的制作方法
本发明涉及分子生物学，具体的说是基因间共表达调控序列、DNA重组和质粒转化合适的宿主细胞等基因工程学，以及通过基因工程学方法重组的双基因共表达质粒的用途。
7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)是半合成头孢类抗生素的母核，在临床医药的生产中具有重要的应用价值。使用生物转化法取代传统的化学法裂解头孢菌素C(cephalosporin C，CPC)生产7-ACA的工艺路线，由于具有反应条件温和，不接触有毒有害化学药品和溶剂，无环境污染等优点，其研究一直受到产业界与学术界的共同重视。生物转化CPC生成7-ACA的过程，分为一步酶法与两步酶法两种(见
图1)，其中一步酶法，即用CPC酰化酶催化CPC脱去7-位的D-α-氨基己二酰侧链，直接生成产物7-ACA的方法，步骤简单，可使反应一步完成，是生产中最理想的工艺路线。然而，四十余年来，从自然界中分离得到的催化该反应的CPC酰化酶，活力均十分低，远不能达到工业化生产的要求，尚无工业化应用的可能。两步酶法，是指使用不同微生物来源的D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase，DAO)和戊二酰-7-氨基酸头孢烷酸酰化酶(glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase，GA)分两步对CPC进行转化，最终生成7-ACA。首先，CPC被DAO酶促氧化脱氨，生成相应的α-酮基-己二酰-7ACA(α-keto-adipyl-7-aminocephalosporanic acid，AKA-7ACA)和H2O2，AKA-7ACA再在H2O2的作用下非酶促氧化脱羧，生成戊二酰-7-ACA(glutaryl-7-aminocephalosporanicacid，GL-7ACA)。而后，经GA催化，水解GL-7ACA的戊二酰基侧链生成7-ACA。该法在当前7-ACA的工业生产中，是切实可行的工艺路线。然而如图所示，因微生物中的过氧化氢酶对H2O2的破坏活性而对转化反应产生干扰。
早在1994年，魏中荻等设计了利用产DAO的三角酵母和产GA的基因工程菌细胞在同一反应器内直接转化CPC为7-ACA的酶法转化过程(CN专利申请号94112285.9)，但需使用叠氮化钠等有毒物质抑制过氧化氢酶活力。随着GL-7ACA酰化酶基因(acy)与D-氨基酸氧化酶基因(daao)先后被克隆(杨蕴刘等，生物工程学报，1991；刘洪波等，生物工程学报，15(3)，337-342，1999)，以及适合应用于CPC转化反应的基因工程宿主菌E.coli MMR204和E.coli D11的成功构建(CN 98110964.0，1998年；CN 98122876.3，1998年)，利用产双酶的基因工程菌细胞，直接转化CPC为7-ACA已成为可能。将两菌二次发酵变为单菌一次发酵，并使双反应罐的两步酶反应在单一反应罐中一步完成，达到简化产酶菌的发酵和酶促转化工艺之目的。
本发明的目的之一是提供一种同时含D-氨基酸氧化酶基因和戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因的双基因共表达质粒。
本发明的目的之二是提供上述共表达质粒的构建方法。
本发明的目的之三是提供上述共表达质粒的用途。
本发明的双基因共表达质粒是一种包含戊二酰-7-氨基头孢烷酸(GL-7ACA)酰化酶基因(acy)与D-氨基酸氧化酶基因(daao)的质粒，结构如下所示 ，式中，n＝0或1，P＝0或Not I，R＝EcoR I或HindIII；(daao-acy)m两个基因相连接的顺序及其多变体可以按多聚体形式存在于质粒中，其中m＝1-3。
当n＝0，P＝Not I，R＝EcoR I时，所述重组质粒为pMSS，结构式是 ，该质粒转化大肠杆菌后可得到含双基因共表达质粒的菌种，该菌种已于2001年1月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其简称为CGMCC，保藏号为No.0533，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)；当n＝1，P＝0，R＝HindIII时，所述重组质粒为pMSTO，结构式是
，该质粒转化大肠杆菌可得到含双基因共表达质粒的菌种，该菌种已于2001年1月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其简称为CGMCC，保藏号为No.0534，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
上述重组质粒转化的宿主菌可以是大肠杆菌E.coli JM109、E.coli MMR204或E.coli D11等。
本发明采用基因重组的方法，使戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因(acy)与D-氨基酸氧化酶基因(daao)置于同一个启动子或分别在各自的启动子的调控下，获得双基因共表达质粒，该双基因共表达质粒转化大肠杆菌得到基因工程菌后，接种于培养基并经生长培养，可同时表达DAO与GA的活力。下面通过六个方面对本
发明内容
进行详细阐述，即重组质粒pMSS与pMSTO的构建、表达方法及其应用于对CPC的转化。
本发明所涉及的研究材料见表1表1菌株与质粒
重组质粒pMSS的构建本发明提供一种新的重组质粒pMSS，它是双链环状DNA，长度为8.2kb。它的构建过程如图2所示。我们设计将daao及acy基因重组到一个DNA载体质粒上，以使同一个基因工程菌细胞中同时产生DAO与GA两种酶，使得转化CPC生成7-ACA的两步酶反应能在同一细胞中一步完成。为此，我们利用限制性内切酶EcoRI和HindIII分别消化含acy基因的质粒pKKCAIS，并将所得acy基因片断与经同样酶切的载体质粒pET28b相连，得到重组质粒pMST。接着再用限制性内切酶NheI和NotI将acy基因片断从pMST上切下，与经SpeI和NotI酶切，含dao基因的重组质粒pJL相连。由于经NheI和SpeI酶切的末端可以互补，经T4DNH连接酶催化的连接反应，acy基因片断被插入到pJL中，并位于daao基因的下游，与daao基因串联，该两基因的转录均处于trc启动子控制之下。
重组质粒pMSTO的构建本发明提供一种新的重组质粒pMSTO，它是双链环状DNA，长度为8.3kb，它的构建过程如图3所示。在本工作1项构建所得重组质粒pMSS中，由于acy基因距离trc启动子较远，由trc启动子控制的acy基因的表达可能偏弱。因此，在重组质粒pMSTO的构建设计中，使daao和acy基因分别受各自的启动子所控制。先用NdeI与NotI将acy基因从质粒pMST上切下，与经同样酶切的载体pALTER-Ex1相连，使acy基因插入pALTER-Ex1中tac启动子下游部位。再用HindIII将acy基因连同tac启动子一齐切下，与经同样酶切的受体质粒pJL相连，使tac启动子和acy基因插在daao基因下游，得到重组质粒pMSTO。
重组质粒pMSS、pMSTO在E.coli MMR204中的表达分别用pMSS与pMSTO质粒DNA转化E.coli MMR204，转化子经纯化后接种于LB液体培养基(组成成分为胰胨0.5％、酵母粉1.0％、NaCl1％，PH7.0)，37℃振摇培养过夜，再以1％接种量移种到装60mlLB的500ml三角瓶中，继续于37℃振摇培养，6hr起每隔两小时取一次样，测定发酵液中的GL-7ACA酰化酶活力及DAO活力。结果显示pMSS与pMSTO在E.coliMMR204为宿主时，均能同时表达DAO与GA活力，培养过程中，两者的产酶趋势略有差异，DAO在12hr左右达到产酶高峰，之后酶活基本保持恒定，而GA活力在24hr左右达到产酶高峰，之后酶活基本不再增加。携带pMSS或pMSTO的E.coli MMR204基因工程菌在LB培养基中，于补加或不补加葡萄糖的条件下培养至36小时测得菌体内DAO和GA活力见表2所示。由表可以看出，于LB中补加葡萄糖，对重组质粒上两酶的表达量有所促进。
表2pMSS和pMSTO在E.coli MMR204中的表达
*培养至16小时后，开始向LB培养基中补加葡萄糖。每次补无0.1％，两小时一次，共补5次。
重组质粒pMSS、pMSTO在E.coli D11中的表达分别用pMSS与pMSTO质粒DNA转化E.coli D11感受态细胞，转化子经纯化后接种于LB液体培养基，37℃振摇培养过夜，再以1％接种量移种到装60mlLB的500ml三角瓶中，继续振荡培养。36hr时取样，测定它们在补糖与不补糖条件下生产DAO及GA的情况，结果如表3所示。可以看出，pMSS与pMSTO在E.coli D11中均能同时表达DAO与GA活力。通过往LB中补加葡萄糖，可以提高它们表达的两酶活力。而GA活力的提高更为明显。
表3pMSS和pMSTO在E.coli D11中的表达
*培养至16小时后，开始向LB培养基中补加葡萄糖。每次补充0.1％，两小时一次，共补5次。
携带质粒pMSS或pMSTO同时表达DAO与GA的基因工程菌细胞应用于转化CPC的反应，直接转化头孢菌素C生成7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。
E.coli MMR204(pMSS)或E.coli MMR204(pMSTO)对CPC的转化由于E.coli.MMR204(pMSS)和E.coli MMR204(pMSTO)对CPC的转化的情况基本相同，故仅以E.coli MMR204(pMSTO)为例，来说明E.coli MMR204(pMSS)或E.coli MMR204(pMSTO)对CPC进行转化的情况。将E.coli MMR204(pMSTO)菌体与5ml 10g/L的CPC溶液按实施例5的要求混合并反应。图3是反应进行过程中反应液内残留CPC(％)、7-ACA生成率、及AKA-7ACA相对积累(以反应液中积累AKA-7ACA最多时AKA-7ACA的浓度为100％)随时间的变化图。图6是转化反应进行至220分钟时反应液的HPLC检测图。从图4可以看出，反应体系中产物7-ACA的增加十分缓慢，而反应中间产物酮酸AKA-7ACA在反应体系中不断积累，在整个反应中浓度一直呈上升趋势。反应至220分钟时，7-ACA的生成率仅11.05％。从图5可以看到，转化反应进行至220分钟时，反应液中积累的AKA-7ACA的峰面积很大，而产物7-ACA峰面积较小。出现这种现象的原因乃是由于MMR204染色体上编码过氧化氢酶的基因(katG，katE)表达，产生的过氧化氢酶活性，使得DAO催化CPC氧化脱氨反应中生成的H2O2被破坏，干扰AKA-7ACA的氧化脱羧而堆积，导致进一步转化反应的终止。
E.coli D11(pMSS)或E.coli D11(pMSTO)对CPC的转化由于E.coli D11(pMSS)和E.coli D11(pMSTO)对CPC的转化的情况基本相同，故仅以E.coli D11(pMSTO)为例，来说明产双酶菌株对CPC进行酶促转化的情况。将E.coli D11(pMSTO)菌体与5m1 10g/L的CPC溶液按实施例5的要求混合并反应。图5是反应进行时反应液中残留CPC(％)、7-ACA生成率、及AKA-7ACA相对积累(以反应液中积累AKA-7ACA最多时AKA-7ACA的浓度为100％)随时间的变化图。图7是转化反应进行至220分钟时反应液的HPLC检测图。从图5可以看出，由于宿主菌E.coli D11中的过氧化氢酶已被钝化失活，故整个反应进行中只有少量酮酸AKA-7ACA积累，且反应至90分钟时酮酸积累已达饱和，此后不断下降。反应体系中产物7-ACA则随反应的进行不断增加，至240分钟时，CPC已被转化完毕，基本不发生AKA-7ACA积累，7-ACA的生成率可达74.16％。
本发明通过以下实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
实施例1重组质粒pMSS构建的实验步骤本实施例中涉及的酶切、连接，或受态细胞制备、电击转化等分子生物学方法均参考“Molecular Cloning-A laboratory Mannual”ed.by J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，1989，CSHL Press.步骤1.用限制性内切酶EcoRI和HindIII对质粒pKKCAIS进行完全酶切，用华舜公司的胶回收试剂盒回收pKKCAIS酶切后产生的2.5kb的酰化酶基因(acy)片断。步骤2.用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化质粒pET28b。酶反应结束后分别用酚，酚∶氯仿(1∶1)抽提酶反应液，以去除反应液中的酶蛋白。之后加入两倍体积的无水乙醇沉淀DNA，DNA重溶于重蒸水中。步骤3.混合由步骤1得到的acy基因片断及步骤2得到的线性化pET28b载体DNA，加入T4 DNA连接酶，于16℃反应12小时。步骤4.将步骤3的连接混合液经酚，酚∶氯仿(1∶1)分别抽提后，加入1/3体积，7.5M的醋酸铵溶液及2倍体积无水乙醇沉淀连接反应液中的DNA，重溶于5ul重蒸水中。用lul重悬的DNA电击转化E.coli JM109的感受态细胞，在含50ug/ml卡那霉素的LB培养基上获得转化子。进一步选取数个转化子抽提DNA并酶切鉴定，确定转化菌的质粒DNA中含有2.5kb的外源acy基因片断，该质粒命名为pMST。步骤5.用限制性内切酶NheI和NotI对质粒pMST进行完全酶切，用华舜公司的胶回收试剂盒回收pMST酶切后产生的2.5kb的酰化酶基因(acy)片断。步骤6.用限制性内切酶SpeI和NotI消化质粒pJL。酶反应结束后分别用酚，酚∶氯仿(1∶1)抽提酶反应液，以去除反应液中的酶蛋白。之后加入两倍体积的无水乙醇沉淀DNA，DNA重溶于重蒸水中。步骤7.由于NheI与SpeI酶切后产生的粘性末端可以匹配。故混合步骤5得到的acy基因片断和步骤6得到的线性化pJL载体质粒DNA，加入T4 DNA连接酶，于16℃反应12小时。步骤8.将步骤7的连接混合液经酚，酚∶氯仿(1∶1)分别抽提后，加入1/3体积，7.5M的醋酸铵溶液及2倍体积无水乙醇沉淀连接反应液中的DNA，重溶于5ul重蒸水中。用1ul重悬的DNA溶液电击转化E.coli JM109的感受态细胞，在含50ug/ml氨卞青霉素的LB培养基上获得转化子。进一步选取数个转化子抽提DNA并酶切鉴定，确定转化菌的质粒DNA中含有2.5kb的外源acy基因片断，该质粒命名为pMSS。
实施例2重组质粒pMSS的构建的实验步骤本实施例中涉及的酶切、连接，或受态细胞制备、电击转化等分子生物学方法均参考“Molecular Cloning-A laboratory Mannual”ed.by J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，1989，CSHL Press.步骤1.用限制性内切酶EcoRI和HindIII对质粒pKKCAIS进行完全酶切，用华舜公司的胶回收试剂盒回收pKKCAIS酶切后产生的2.5kb的酰化酶基因(acy)片断。步骤2.用限制性内切酶NotI和NdeI对实施例1，步骤4所得质粒pMST进行完全酶切，用华舜公司的胶回收试剂盒回收pMST酶切后产生的2.5kb的酰化酶基因(acy)片断。步骤3.用限制性内切酶NotI和NdeI消化质粒pALTER-Ex1。酶反应结束后分别用酚，酚∶氯仿(1∶1)抽提酶反应液，以去除反应液中的酶蛋白。之后加入两倍体积的无水乙醇沉淀DNA，DNA重溶于重蒸水中。步骤4.混合由步骤1得到的acy基因片断及步骤3得到的线性化pALTER-Ex1载体DNA，加入T4 DNA连接酶，于16℃反应12小时。步骤5.将步骤4的连接混合液经酚，酚∶氯仿(1∶1)分别抽提后，加入1/3体积，7.5M的醋酸铵溶液及2倍体积无水乙醇沉淀连接反应液中的DNA，重溶于5ul重蒸水中。用1ul重悬的DNA电击转化E.coli JM109的感受态细胞，在含25ug/ml四环素的LB培养基上获得转化子。进一步选取数个转化子，抽提DNA并酶切鉴定，确定转化菌株所含质粒DNA中带有2.5kb的外源acy基因片断，该质粒命名为pMSTW。步骤6.用限制性内切酶HindIII对质粒pMSTW进行完全酶切，用华舜公司的胶回收试剂盒回收pMSTW酶切后产生的前端连有tac启动子的酰化酶基因(acy)片断。步骤7.用限制性内切酶HindIII消化质粒pJL。酶反应结束后分别用酚，酚∶氯仿(1∶1)抽提酶反应液，以去除反应液中的酶蛋白。之后加入两倍体积的无水乙醇沉淀DNA，DNA重溶于重蒸水中。步骤8.混合步骤5得到的带tac启动子的acy基因片断和步骤6得到的线性化pJL质粒DNA，加入T4 DNA连接酶，于16℃反应12小时。步骤9.将步骤7的连接混合液经酚，酚∶氯仿(1∶1)分别抽提后，加入1/3体积，7.5M的醋酸铵溶液及2倍体积无水乙醇沉淀连接反应液中的DNA，重溶于5ul重蒸水中。用1ul重悬的DNA电击转化E.coli JM109的感受态细胞，在含50ug/ml氨卞青霉素的LB培养基上获得转化子。进一步选取数个转化子抽提DNA并酶切鉴定，选取其中pJL获得了插入带tac启动子的外源acy基因片断的重组质粒，该质粒命名为pMSTO。
实施例3GL-7ACA酰化酶活力测定的实验步骤本实验步骤参考文献魏中荻，杨蕴刘，金志坤等，中国专利，公开号1995 CN1104255A取0.5ml发酵液，4000rpm离心10分钟，弃上清液，并用3ml磷酸缓冲液稀释6倍。然后取0.5ml稀释菌液，于37℃预热10分钟，再加入0.5ml预热底物(5mg/ml GL-7-ACA，用同样磷酸缓冲液现配)，37℃水浴反应30分钟。加入3ml终止液和0.5ml显色液。静置30分钟后，于4000rpm离心15分钟。取上清液于415nm测定光吸收值。空白对照则先加终止液，后加底物，其余同上。
酶活力(u/m1)＝k×O.D.415×稀释倍数(6倍)/(272×t×D)k标准曲线的斜率t反应时间30minD反应加入菌液的体积0.5ml2727-ACA分子量一个单位的GL-7ACA酰化酶活力定义为特定反应条件下(37℃，0.1mol/LpH7.0磷酸缓冲液)每分钟能转化GL-7ACA生成1μmol 7-ACA的所需酶量。
实施例4D-氨基酸氧化酶活力测定的实验步骤本实验步骤参考Aschwini et al，J Biosci 1987，11137～144取0.5mld-氨基酸氧化酶基因工程菌发酵液，4,000rpm离心15分钟以收集菌体。再将湿菌体经-20℃冻融，加入5ml用焦磷酸缓冲液(0.1M，pH8.5)配制的50mM DL-甲硫氨酸溶液，于37℃振荡反应30分钟。然后用3ml 10％三氯乙酸终止反应。将反应液于4000rpm离心15分钟，取上清液稀释10倍，再取1ml加入0.4ml 0.2％的2，4-二硝基苯肼，静置10分钟，而后加入1.5ml3N的氢氧化钠，静置15分钟，再离心、取上清液在550nm下测光吸收值，代入用丙酮酸钠制备的标准曲线得出的公式，计算出酶活单位。酶活力(u/ml)＝k×O.D550×稀释倍数/tk标准曲线的斜率
t反应时间30min一个酶活单位的D-氨基酸氧化酶定义为在特定应条件下(37℃，pH8.5)每分钟氧化脱氨生成1μmol酮酸所需酶量。
实施例5DAO、GA基因工程菌转化CPC的实验步骤将所构造的DHO、GA工程菌的菌体细胞与10g/L的CPC-Na盐溶液混合，加入1％(wt/vo1)的舒巴坦钠以抑制重组质粒上的氨卞抗性基因编码的β-内酰胺酶对CPC及其衍生物的破坏。于28℃水浴200转/min振荡反应，以5％氨水维持反应液pH7.0。半小时取样一次，用HPLC监测反应进行的程度及反应物、产物浓度的变化。直至CPC转化反应完成。
实施例6HPLC检测的实验步骤使用Beckman Gold System HPLC，填料直径5μ，柱容4.6mm×25cm的Ultrasphere ODS反相色谱柱，流速1ml/min，压力1.7～2.2 Kpsi，流动相为7.5％乙腈-15％甲醇-1％乙酸，在245nm的波长下检测CPC及其衍生物。
权利要求
1.一种包含戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因(acy)与D-氨基酸氧化酶基因(daao)的双基因共表达质粒，结构如下所示 ，式中，n＝0或1，P＝0或Not I，R＝EcoR I或HindIII。
2.如权利要求
1所述的双基因共表达质粒，其特征是具有如下结构式
3.如权利要求
1所述的双基因共表达质粒，其特征是具有如下结构式
4.如权利要求
2所述的双基因共表达质粒，其特征是该质粒转化大肠杆菌得到大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.0533。
5.如权利要求
3所述的双基因共表达质粒，其特征是该质粒转化大肠杆菌得到大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.0534。
6.如权利要求
1所述的双基因共表达质粒，其特征是(daao-acy)m两个基因相连接的顺序及其多变体可以按多聚体形式存在于质粒中，其中m＝1-3。
7.如权利要求
1所述的双基因共表达质粒的构建及表达方法，其特征是采用基因重组的方法，使戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因(acy)与D-氨基酸氧化酶基因(daao)置于同一个启动子或分别在各自的启动子的调控下，获得双基因共表达质粒，该双基因共表达质粒转化大肠杆菌得到基因工程菌后，接种于培养基，经生长培养后表达。
8.如权利要求
7所述的双基因共表达质粒的构建方法，其特征是所述的启动子是启动子trc或启动子tac。
9.如权利要求
7所述的双基因共表达质粒的构建方法，其特征是所述的基因工程菌的宿主菌是大肠杆菌E.coli JM109、E.coli MMR204或E.coli D11。
10.如权利要求
1所述的双基因共表达质粒的用途，其特征是用于直接转化头孢菌素C生成7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。
专利摘要
本发明涉及一种同时含D－氨基酸氧化酶基因和戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶基因的双基因共表达质粒。该质粒是通过基因重组的方法,使戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶基因(acy)与D－氨基酸氧化酶基因(daao)置于同一个启动子或分别在各自的启动子的调控下获得。该质粒转化大肠杆菌得到基因工程菌如CGMCC No.0533、CGMCC No.0534,可应用于直接转化头孢菌素C生成7－氨基头孢烷酸(7－ACA)。
文档编号C12N1/21GKCN1371999SQ01105485
公开日2002年10月2日 申请日期2001年2月28日
发明者杨蕴刘, 朱彤波, 张益棻, 姜卫红, 陈军, 焦瑞身 申请人:中国科学院上海植物生理研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan