R50的氨基酸序列的MTHFR50核巧酸 序列巧70个核巧酸），如序列表中SEQ ID NO: 5所示；甲酯四氨叶酸脱甲酯酶D肥50位于 DMT50下游167bp处，其氨基酸序列（287个氨基酸），如序列表中SEQ ID N0:6所示，编码 相应于所述甲酯四氨叶酸脱甲酯酶D肥50的氨基酸序列的D肥50核巧酸序列巧64个核巧 酸），如序列表中SEQ ID ^:7所示；次甲基环化酶^肥50位于01150下游48926口处，其 氨基酸序列（298个氨基酸），如序列表中SEQ ID NO: 8所示，编码相应于所述次甲基环化酶 MT肥50的氨基酸序列的MT肥50核巧酸序列巧97个核巧酸），如序列表中SEQ ID NO: 9所 /J、- 〇
[0111] 第=实施例、脱甲基酶DMT50的体外高效表达及功能鉴定
[0112] 1、细菌表达载体的构建和重组微生物获得 [011引 （1)DMT50基因的PCR扩增
[0114] 设计一对引物：
[01 巧]引物 1 ; 5-CGGGGTACCATGAGGGAGGCTGAAGTGAAGTCC-3 (下划线为 KpnI 酶切位点）， 如序列表中SEQ ID NO: 10所示；
[0116] 引物 2 ；5-CCCAAGCTTCTACGCCCGCGCTGCCACGC-3 (下划线为 Hind III酶切位点），如 序列表中SEQ ID NO: 11所示；
[0117] 用下述PCR扩增体系从所述菌株化lbn-20基因组DM中扩增DMT50基因；
[011 引
【主权项】
1. 一种蛋白质，其特征在于，具有SEQ ID NO:2所不的氣基酸序列组成的蛋白质。
2. -种基因，其特征在于，包括： (a) 编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列；或 (b) 在严格条件下与（a)限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或 (c) 具有SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列；或 (d) 具有SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列。
3. -种组合蛋白，其特征在于，包括至少由第一核苷酸序列和第二核苷酸序列编码，所 述第一核苷酸序列编码权利要求1所述蛋白质。
4. 根据权利要求3所述组合蛋白，其特征在于，所述第二核苷酸序列编码甲基四氢叶 酸还原酶、甲酰四氢叶酸脱甲酰酶和/或次甲基环化酶。
5. 根据权利要求4所述组合蛋白，其特征在于，所述甲基四氢叶酸还原酶具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列，所述甲酰四氢叶酸脱甲酰酶具有SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列， 所述次甲基环化酶具有SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列。
6. 根据权利要求5所述组合蛋白，其特征在于，所述第二核苷酸序列具有SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7和/或SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。
7. 根据权利要求6所述组合蛋白，其特征在于，编码所述组合蛋白的核苷酸序列具有 SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列。
8. 根据权利要求7所述组合蛋白，其特征在于，编码所述组合蛋白的核苷酸序列具有 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
9. 一种表达盒，其特征在于，包含在有效连接的调控序列调控下的权利要求2所述基 因或编码权利要求3-8任一项所述组合蛋白的核苷酸序列。
10. 根据权利要求9所述表达盒，其特征在于，所述调控序列为叶绿体转运肽，所述叶 绿体转运肽与权利要求2所述基因有效连接。
11. 根据权利要求10所述表达盒，其特征在于，所述叶绿体转运肽的核苷酸序列具有 SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列。
12. -种包含权利要求2所述基因、编码权利要求3-8任一项所述组合蛋白的核苷酸序 列或权利要求9-11任一项所述表达盒的重组载体。
13. -种增加耐受除草剂范围的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述蛋白质、权 利要求3-8任一项所述组合蛋白或权利要求9-11任一项所述表达盒编码的蛋白质在植物 中与至少一种不同于权利要求1所述蛋白质、权利要求3-8任一项所述组合蛋白或权利要 求9-11任一项编码的蛋白质的第二种蛋白质一起表达。
14. 根据权利要求13所述增加除草剂耐受性的方法，其特征在于，所述第二种蛋白质 为草甘膦耐受性蛋白质、草铵膦耐受性蛋白质、α酮戊二酸双加氧酶、4-羟苯基丙酮酸双 加氧酶、乙酰乳酸合酶、细胞色素类蛋白质或原卟啉原氧化酶。
15. -种选择转化的植物细胞的方法，其特征在于，包括：用权利要求2所述基因、编码 权利要求3-8任一项所述组合蛋白的核苷酸序列或权利要求9-11任一项所述表达盒转化 多个植物细胞，并在允许表达所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列或所述表达盒的 转化细胞生长，而杀死未转化细胞或抑制未转化细胞生长的除草剂浓度下培养所述细胞， 所述除草剂为麦草畏。
16. -种控制杂草的方法，其特征在于，包括：对种植植物的大田施用有效剂量的麦草 畏除草剂，所述植物包含权利要求2所述基因、编码权利要求3-8任一项所述组合蛋白的核 苷酸序列、权利要求9-11任一项所述表达盒或权利要求12所述重组载体。
17. -种保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，包括：将权利要求2 所述基因、编码权利要求3-8任一项所述组合蛋白的核苷酸序列、权利要求9-11任一项所 述表达盒或权利要求12所述重组载体导入植物，使导入后的植物产生足够保护其免受麦 草畏损害量的除草剂耐受性蛋白质。
18. -种赋予植物麦草畏除草剂耐受性的方法，其特征在于，包括：将权利要求2所述 基因、编码权利要求3-8任一项所述组合蛋白的核苷酸序列、权利要求9-11任一项所述表 达盒或权利要求12所述重组载体导入植物。
19. 一种控制草甘膦耐受性植物的大田中草甘膦耐受性杂草的方法，其特征在于，包 括：对种植草甘膦耐受性植物的大田施用有效剂量的麦草畏，所述草甘膦耐受性植物包含 权利要求2所述基因、编码权利要求3-8任一项所述组合蛋白的核苷酸序列、权利要求9-11 任一项所述表达盒或权利要求12所述重组载体。
20. -种产生麦草畏耐受性植物的方法，其特征在于，包括向所述植物的基因组中引 入权利要求2所述基因、编码权利要求3-8任一项所述组合蛋白的核苷酸序列或权利要求 9-11任一项所述表达盒，以产生麦草畏耐受性植物。
21. 根据权利要求20所述产生麦草畏耐受性植物的方法，其特征在于，包括：通过将亲 本植物自交或与第二种植物杂交而产生麦草畏耐受性植物，所述亲本植物和/或第二种植 物包含权利要求2所述基因、编码权利要求3-8任一项所述组合蛋白的核苷酸序列或权利 要求9-11任一项所述表达盒，所述麦草畏耐受性植物遗传了来自所述亲本植物和/或第二 种植物的所述基因、编码所述组合蛋白的核苷酸序列或所述表达盒。
22. -种培养对麦草畏除草剂具有耐受性的植物的方法，其特征在于，包括： 种植至少一粒植物种子，所述植物种子的基因组中包括权利要求2所述基因、编码权 利要求3-8任一项所述组合蛋白的核苷酸序列或权利要求9-11任一项所述表达盒； 使所述植物种子长成植株； 用有效剂量麦草畏除草剂喷洒所述植株，收获与其他不具有所述除草剂耐受性基因、 编码所述组合蛋白的核苷酸序列或所述表达盒的植株相比具有减弱的植物损伤的植株。
23. 根据权利要求13-22任一项所述方法，其特征在于，所述植物为大豆、棉花、玉米、 水稻、小麦、甜菜或甘蔗。
24. -种好氧型四氢叶酸依赖型的脱甲基酶耐受麦草畏除草剂的用途。
【专利摘要】本发明涉及一种除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途，所述蛋白质具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明除草剂耐受性蛋白质特别适合在植物中表达，尤其定位于叶绿体中表达，可以增强对麦草畏除草剂的耐受性，且应用前景广。M 201455020141105
【IPC分类】C12N9-78, C12N15-53, C12N15-55, A01H1-02, C12N9-06, C12N9-80, C12N9-02, C12N15-84, A01G7-06, A01H5-00
【公开号】CN104630162
【申请号】CN201410810953
【发明人】何健, 姚利, 贾兴军, 谢香庭, 吴业春, 陶青, 丁德荣
【申请人】北京大北农科技集团股份有限公司生物技术中心, 南京农业大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2014年12月22日