的EES中也被观察到。由于转铁蛋白和低密度脂蛋白是通过胞内体和溶酶体实现降解和再循环利用的，Numb参与其过程，说明在早期胞内体对接过程中Numb发挥通用的作用。但是Numb-1ike缺失后，却没有出现上述相似的实验结果，证明是Numb而不是Numb like在胞内体融合过程中发挥作用。
[0095]请参阅图20至22，通过检测了 Numb-KD对EES Rab5阳性且Rab5_RFP表达的细胞的影响，确认Numb以一种普遍存在的方式调控胞内体的对接。与其相比，大约70%的Rab5阳性小泡能够完成聚集、对接和融合过程。而在Numb-KD中，比例只有36%，并且观察到的长时间聚集在一起的胞内体，且这些胞内体并未发生稳定对接，而是在彼此周边进行摇摆震荡，这证明EES的对接过程受到了影响。在对照细胞和Numb-KD细胞中，EES对接完成之后和融合启动的过程没有显著差异，说明Numb不影响融合过程。
[0096]请参阅图23至24，通过细胞体外实验证明Numb影响EES对接过程。最近发展起来利用距离评价成对的EES的行为，将这个原理应用于评价Rab5-RFP过表达的细胞中Numb-KD在EES中的作用。任意选定的红色标记的囊泡和其相邻的囊泡，通过实时细胞成像系统观察其后的动力学过程。在对照细胞中，10s的时间内，距离小于10nm成对的囊泡中85%最终完成融合，距离在100-200nm之间的囊泡有63%最终完成融合，距离在200_400nm之间的囊泡只有20%最终发生融合，距离大于400nm的没有实现融合。这个数据说明胞内体的距离和最终完成融合具有紧密的联系。根据这个结果，我们将距离小于10nm的囊泡群体成为正在对接或融合的群体，因为这些囊泡在接下来很短的时间即可完成融合。距离在100-400nm之间的称为聚集群体，这些群体可以完成融合，但需要一定的时间。依赖这个定义，发现MCF7A和HEK293T细胞中Numb敲除后，大部分囊泡的距离为200_400nm，而距离小于10nm可发生融合的囊泡的比例明显减少。这个数据证明，Numb是胞内体对接所需要的。
[0097]实施例三:
证明细胞内Numb 65和Numb 71调控早期胞内小体的融合:
在哺乳动物细胞中根据剪切方式的不同，Numb 一共有4种类型，分别是Numb 65、Numb66 > Numb 71、Numb 72，连同Numb like，在哺乳动物细胞中一共有五种Numb蛋白。
[0098]请参阅图25，在MCF7A中敲除Numb后，过表达相应的Numb蛋白。过表达Numb 65和Numb 71可以重新出现正常融合，而Numb 66、Numb72和Numb like则不能恢复融合。详细的定量分析表明:过表达Numb 66、Numb72和Numblike对胞内体的大小无明显影响，而Numb 65和Numb 71过表达可以明显提高胞内体的大小。另外，过表达Numb 65和Numb 71明显提高较大胞内体(多0.2m2)的比例，减少较小胞内体((0.1m2)的比例，这些数据显不只有Numb 65和Numb 71而不是Numb 66、Numb72和Numb like在胞内体融合过程中发挥作用。
[0099]实施例四:
证明Numb调控胞内小体的融合是通过细胞因子实现的:
采取了体外融合实验，以证明Numb在EE对接和融合中的作用和探索其内在的机理。请参阅图26，胞内小体用激发光488nm或555nm标签标记37°C孵育5min，分离核周质上清液(PNS)，里面包含标记的胞内小体和可溶性细胞因子，将其放入含有ATP、细胞溶质和相应的缓冲液。请参阅图27和28，胞内小体发生融合的数量通过记录同时产生两种颜色的小泡来计算。实验发现Numb KD在对照组和Numb KD MCF7A细胞中对体内标记没有影响。在实验中发现，在37°C孵育40min条件下，来自于对照MCF7A细胞的细胞质和PNS，可以产生明显的融合现象。而来自于Numb KD细胞的细胞质和PNS，产生融合的数量要少50%。小泡融合异常会减少体积较大小泡的数量。请参阅图29，在Numb KD细胞中大于2.0um的数量与对照相比少37%。另外，Numb KD明显减少了小于0.5um2胞内体的数量，这表明Numb KD能够影响小泡膜融合后定位，这些结果均证明在体外Numb可调控EE对接和融合。
[0100]请参阅图29，在实验中，我们采用正常细胞的细胞质和Numb-KD细胞的核周质上清液共同孵育，结果显示其可以产生与对照细胞相同的融合情况和囊泡大小。这表明，Numb是通过一个未知的细胞因子调控EE融合的。
[0101]实施例五:
证明Numb可以与Monla和Monlb相互作用:
请参阅图30、31和32，通过免疫共沉淀实验证明，Numb可以与哺乳动物细胞中和酵母小泡融合调控因子Monl同源的Monla和Monlb结合。酵母总Monl是顺式-SNARE的一部分，且是反式-SNARE配对所必须的。在哺乳动物细胞中发现其有两个同源基因分别是Monla和Monlb，最近的实验证明它们是早期和晚期胞内小体转运所必须的。构建了一系列的Numb的突变体，证明Numb的PTB和PRR结构域是Numb和Monl结合所必须的。Numb有5种异构体，免疫共沉淀实验证明所有的Numb异构体都可以与Monl相互作用，虽然只有Numb 65和Numb 71胞内小体融合中发挥作用，这证明Numb与Monl的相互作用在细胞生理活动中有更广泛的作用。
[0102]实施例六:
证明Numb可以从细胞质中招募Monlb定位到早期胞内小体上:
请参阅33和34，利用Monla和Monlb的抗体进行免疫共沉淀实验证明在对照细胞中显示阳性信号，而在Numb-KD细胞中Monla和Monlb的信号分别减弱57%和67%，请参阅图35、36和37。请参阅图38、39和40，这种由于Numb KD而导致Monla在亚细胞中分布的改变通过Monla-myc和Monla-GFP蛋白进一步被证实。请参阅图34，利用Monlb和EEAl抗体免疫共沉淀检测证明，是Monlb而不是Monla定位在EEs上，并且Numb KD明显减少了 Monla在EEs上的分布。请参阅图41至44，为了进一步证明Numb和Monl在亚细胞中的分布定位，在MCFA细胞中过表达Rab5-RFP蛋白(已被证明其可以提高EE的融合)，发现只有部分Monlb而不是Monla与Rab5-RFP共定位，并且Numb KD明显减少了 Monlb与Rab5-RFP共定位的数量；只有Monlb而不是Monla出现在Rab5或EEAl标记的EEs上，并且Numb仅仅与Monlb出现共定位，而不是Monla，所有这些说明仅有Monlb涉及到EE的对接与融合。
[0103]实施例七:
证明Monlb是早期胞内小体融合的重要对接调控因子:
请参阅图45，在MCF7A细胞中，我们通过RNA干扰方法降低Monla或Monlb的表达，通过Western blotting和qRT-PCR结果确认Monl基因表达明显下调。请参阅图46至50，Monla KD对EEs的融合没有影响，然而Monlb KD影响EEs的融合并且发生聚集的EEs增加75%，发现沉默Monlb后而不是Monla明显减小了 Rab5或HGS标记的EEs的体积，这表明只有Monla影响EEs的融合。接下来我们在Monla和Monlb沉默细胞中，开展了时间延滞实验，Monlb KD细胞中EEs出现长时间聚集而不发生对接和融合，Monla KD细胞中EEs的融合与对照相比没有发生明显的变化，这些数据证明，Monlb是EE对接所必须的。
[0104]实施例八:
证明Numb调控早期胞内小体的对接是通过Monlb来实现的:
在Monlb KD的MCF7A细胞中过表达Numb的五个不同类型的蛋白，然后用ant1-EEAl标记，荧光共聚焦检测EEs的融合情况，从而得到在EEs融合过程中Numb和Monlb之间的关系。在Monlb KD细胞中，过表达所有的Numb蛋白包括Numb 65 and Numb 71，都不能使EEs发生融合。请参阅图51和52，图像显示在这些细胞中，EEs均是严重的发生堆积。统计显示，所有的Numb异性结构蛋白都不能挽救EEs发生融合异常的情况，因此，说明Monlb是Numb调控EES融合所必须的。也说明，Numb是调控上游或是和Monlb共同调控EEs的融合。
[0105]实施例九:
证明Monlb可以从cis-SNARE上解离NSF，进而控制SNARE的循环利用:
在酵母中，Monlb是cis-SNARE的一部分，它的突变将会导致trans-SNARE的配对，因此要考虑Numb和Monlb调控EEs的融合是否通过SNARE复合物实现的。请参阅图53，免疫共沉淀结果显示Monlb可以与SNARE复合体相结合，包括syntaxin 13和syntaxin 6及cis-SNARE解聚因子NSF，但是不能与a_SNAP和VAMP4结合。这说明，Monlb是SNARE复合体的一部分。请参阅图54，NSF、syntaxin 13和syntaxin 6与核周质附近的积累的Monlb具有较好的共沉淀效果，α-SNAP和VAMP4与Monlb几乎没有。特别是Monlb与NSF具有100%的共沉淀，且两者蛋白在EEs的富集区核周质附近具有大量分布。这些结果表明，Monlb调控EE融合是通过SNARE实现的。请参阅图55，证明Numb与SNARE没有直接的相互作用。但是Numb KD细胞中Monlb与NSF的作用明显减弱，这说明Numb通过调控Monlb来作用于SNARE复合体的。
[0106]通过高速离心从正常细胞、Numb KD细胞和Monlb KD细胞中分离胞内小体，与ant1-syntaxin 13 免疫沉淀反应，之后与 NSF、a -SNAP、VtilA、syntaxin 6 和 syntaxin13免疫杂交。请参阅56，结果显不，Numb KD和Monlb KD均不影响ant1-syntaxin 13与胞内小体 SNARE (VtilA and syntaxin 6)和 cis-SNARE 的解离因子(NSF 和 a-SNAP)发生免疫共沉淀反应，说明Numb和Monlb均不直接影响SNARE的组装和解离。但是，请参阅57，意外的发现，过表达Monlb可以显著降低NSF与syntaxinl3的结合，syntaxin 13与SNARE的其它组分的结合未收到影响。请参阅58，通过免疫荧光染色，过表达Monlb可以显著减少NSF在核周质附近的分布，在检测的57个细胞中，有31个细胞中核周质附近的NSF表达量减少，而26个细胞的核周质附近的NSF信号消失。请参阅图59，用免疫共沉淀的方法进一步证明，过表达Monlb可以减少EEs中的NSF，而对SNARE其他组分没有影响。这些结果说明，Monlb可以从SNARE上解离下NSF。
[0107]请参阅图60，在有或没有NSF的MCF7A细胞中过表达Monlb检测EE的形态变化，发现共表达Monlb和NSF可以在核周质附近大量产生较大的EEAl阳性的胞内小体，然而过表达两者中的任何一个都未产生明显的变化。两者共表达的胞内小体的大小是表达GFP-Monlb或Myc-NSF的胞内小体的2倍。胞内体大小分布统计分析表明，共表达两个蛋白不仅