叉反应，证实了本发明核酸适体具有高度的特异性。在鉴别 不同的毒品和类似物方面，具有重大的使用价值。在灵敏度方面，本发明结果显示，基于核 酸适体的可卡因检测比单克隆抗体的检测方法灵敏度要高出5倍。
[0053] 本发明的核酸适体本身是一段单链DNA或RNA，可以耐受高温，pH值得变化，比抗 体具有更高的稳定性，易于长期保存。核酸适体还具有可体外人工化学合成、精确性高、重 复性好、无批次间差异等特点，在毒品、毒物的检测方面具有广阔的前景。
[0054] 术语
[0055] 如本文所用，术语"含有"或"包括"可以是开放式的或封闭式的，即包括了"由…… 构成"。
[0056]SPR
[0057]SPR(表面等离子共振，SurfacePlasmonResonance)是利用金属膜/液面界面光 的全反射连接引起的一种物理光学现象来分析生物分子间相互作用的仪器。
[0058]SELEX筛选
[0059]SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment,指数富 集配体系统进化技术）技术，指由Tuerk和Gold等人开发研究的一种新的组合化学技术。 它应用大容量的随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数级富集与靶分子特 异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，可获得高亲和力、特异性强的寡核苷酸适体（aptamer)。
[0060]SELEX筛选具有库容量大、靶分子范围广等优点。
[0061] 在本发明中，基于本发明人特殊构建的一个ssDNA文库，通过SELEX技术，并经过 多次和多轮筛选，成功获得了多个特异性针对可卡因的核酸适体。
[0062] 本发明所用的ssDNA文库中，ssDNA的全长76bp，中间为40bp的随机核苷酸序列， 由A、G、C、T密码子随机组合。这样，在理论上，可提供440个序列组合，即理论库容量为 1015,因此可以很好地满足筛选适体的需求。
[0063] 在本发明的一个优选实施例中，SELEX筛选方法包括以下步骤：
[0064] 1.DNA适体库的建立
[0065] 第一步是化学合成具有随机序列的核酸适体库，通常选择40个碱基对的随机单 链核苷酸序列，同时包括两端的PCR引物序列，这样的核酸适体库将包含1014_1015种不同的 可能序列。
[0066] 2.建立特异性的DNA适体的筛选方法
[0067] DNA适体与靶分子结合的方法可以选择：1)亲和层析柱方法；2)纳米颗粒偶联法； 3)硝酸纤维膜结合方法、或其组合。
[0068] 一种筛选是用2nmolRND40单链DNA，在50ill反应缓冲液中94r变性10分钟，加 入20ill小分子抗原，37r孵育30分钟，通过离心13000rpml5分钟除去未结合的DNA，并用 250yl反应缓冲液洗涤两次。最终的单链DNA和抗原的复合物溶于50yl水中，进行下一 轮筛选。
[0069] 3.DNA适体与结合的靶分子的分离
[0070] 在本发明中，适用的分离技术包括（但不限于）：使用毛细管电泳结合液相分离， 磁珠分离技术，层析分离技术和离心分离技术等。
[0071] 4?多循环的扩增筛选
[0072] 对筛选到的DNA适体序列进行聚合酶链式反应（PCR)扩增生成次级文库，用于下 轮筛选.经过数轮反复的体外筛选、扩增后，对已达到高亲和力的文库进行单克隆及测序， 从而获得特异性识别靶分子的适配体。
[0073] lul的复合物在lOOul总体积下用PCR放大10个循环，其中镁离子为2. 5mM MgC12,引物为F3(5'GCGGATGAAGACTGGTGT3'）（SEQIDNO. :6)，R3(5'GTTGCTCGTAIT TAGGGC3'）（SEQIDNO. : 7)。
[0074]PCR产物用乙醇沉淀，单链DNA和蛋白在PCR的第一步95°C的变性过程中分离。 为了获得高亲和力的核酸适体，通过在第二、三轮的筛选中将双连DNA的量从0. 5nmol降至 0. 25nmol，以增加SELEX筛选的严谨度。
[0075] 整个筛选步骤通常可包括同样条件的10轮或更多轮筛选，从而筛选出高特异性 和高亲和力的核酸适体。
[0076] 适体
[0077] 如本文所用，"适体"、"适配体"、"适配子"和"aptamer"可以互换使用，指能够与 特定的靶分子（如可卡因）结合的核酸序列，包括DNA适体、RNA适体、杂合类型的适体、或 其他类型的适体。此外，在本发明中，适体还包括单链和双链形式，尤其是单链形式的适体。
[0078] 如本文所用，"核酸适体"和"寡核苷酸适体"可以互换使用。核酸适体是通过SELEX 技术筛选得到的一类寡核苷酸分子，能与靶分子强特异、高亲和力地结合。通常，核酸适体 是一种小的（通常约40-100碱基对）的合成寡核苷酸。
[0079] 如本文所用，术语"本发明的适体"、"本发明的核酸适体"可互换使用，指能够特异 性地和高亲和力地与可卡因结合的核酸适体。
[0080] 在本发明中，一类优选的适体是通过SELEX筛选获得的，序列如SEQIDN0. :1-5 所示的核酸适体。
[0081] 本发明的核酸适体的分子质量小、免疫原性低，且可进行化学合成、改造与标记。
[0082] 如本文所用，术语"特异性"是指本发明的适体能结合于可卡因，较佳地，指那些能 与可卡因结合但不识别和结合于其它毒物的适体。
[0083] 本发明的适体可以用常规方法进行制备，例如人工全合成或PCR方法。
[0084] 本发明核酸适体（Aptamer)是可以折叠成三维结构的、通过空间构型互补与革巴分 子结合的一段短的单链寡核苷酸序列，即单链DNA(ssDNA)或RNA。
[0085] 另外，本发明适体可体外人工化学合成，具有精确性高、重复性好、无批次间差 异、变性与复性可逆、稳定性好并易于长期保存等优点。
[0086] 此外，在本发明中，还可将多功能的分子或可检测标记物准确、有效地连接到适配 体特定位点，从而使得适体更适合对靶分子进行检测。
[0087] 研究表明，适体与靶分子之间分子识别功能与抗体极为相似，但本发明适体对靶 分子（可卡因）具有极高的特异性和亲和力，并且易于进行功能化修饰，故非常适合制备灵 敏、快速、可靠的现场检测制剂和测试片。
[0088] 本发明的核酸适体是从随机的序列库中筛选出来，具有广泛的适用性和高效率。
[0089] 本发明还提供了基于本发明高亲和性和特异性核酸适体的传感器。胶体金纳米颗 粒（GNPs)具有独特的电子、光电和催化特征，使得它的应用十分引人注目。在以往的研究 中，用胶体金来开发核酸适体生物传感器，胶体金通常用来作为重要的显色物质，因为胶体 金颗粒具有很强的可见颜色特征。
[0090] 在本发明中，可通过胶体金交联的核酸适体与互补序列杂交的原理，来检测靶分 子（可卡因）。
[0091] 检测制品
[0092] 本发明还提供了可用于检测可卡因的检测制品。
[0093] 在本发明中，代表性的检测制品包括（但并不限于）：检测试剂、侧流片、芯片、测 试条、检测板。
[0094] 在本发明中，检测试剂的形式没有特别限制，可以是固态、或液体，也可以是微球、 胶体等形式。
[0095] 一类特别有用的检测试剂是本发明适体与可检测标记物形成的偶联物。
[0096] 在本发明中，可检测标记物的种类没有特别限制，代表性的可检测标记物包括 (但并不限于）：生物素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、胶体金、放射性同位 素、乳胶颗粒、抗体、配体、抗原、受体、或其组合。
[0097] 在另一优选例中，所述的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、或其组合。
[0098] 在另一优选例中，所述的化学荧光基团包括EvaGreen、罗丹明、FITC、TRITC、或其 组合。
[0099]在另一优选例中，放射性同位素包括32P、125I、36S等。
[0100] 在另一优选例中，所述的化学发光基团包括鲁米诺等。
[0101] 在本发明中，一类特别优选的检测制品是核酸芯片。在所述核酸芯片上，通常特定 有多种探针，其中，所述芯片包括本发明的特异性针对可卡因的核酸适体，利用本发明适体 与可卡因可形成"适体-可卡因"二元复合物的原理，可检测样本中所含可卡因的存在与否 以及含量。
[0102] 一种优选的检测可卡因的芯片包括固相载体以及有序固定在所述固相载体上的 寡核苷酸，所述的寡核苷酸的序列SEQIDN0:1-4所示的序列。其中，所述固相载体没有特 别限制，可采用基因芯片领域的各种常用材料，代表性的固相载体包括但不限于：尼龙膜， 经活性基团（如醛基、氨基等）修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
[0103] 层析侧流片
[0104] 一种优选的便于现场快速检测的检测制品是利用本发明适体所制备的层析侧流 片。
[0105] 在本发明中，一种