[0173] 采用柠檬酸三钠还原氯金酸（HAuC14)法制备40nm胶体金颗粒。将HAuC14先配 制成0. 01%的水溶液，取100mL加热至沸腾，搅动下准确加入1.OmL的1%柠檬酸三钠水溶 液，继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰 色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。
[0174] 4. 2.胶体金C0C-BSA结合物复合物的制备
[0175] 胶体金标记可卡因完全抗原（C0C-BSA)的制备：取已制备的胶体金100.OmL，用 0?lmol/LK2C03将胶体金溶液调至pH9. 0,在磁力快速搅拌下迅速加入1. 0~2.Omg可卡 因-BSA，搅拌10min后加入1.OmL的10%的牛血清白蛋白，再继续搅拌10min。用高速冷冻 离心机于4°C、12000rpm/min下离心30min，吸去上清液，沉淀即为胶体金C0C-BSA结合物。 用0. 01m〇l/L、pH8. 2Tris-HCl缓冲液稀释至一定浓度后，均匀的浸在玻璃纤维膜上，37°C 干燥备用。
[0176] 4. 3层析测试条的制备
[0177] 依次将样品垫膜、玻璃纤维（固相的胶体金C0C-BSA结合物）、硝酸纤维薄膜和样 品垫粘贴于PVC支持材料上。在硝酸纤维素膜上用点膜机分别划检测线和质控线，检测线 为可卡因核酸适体（SEQIDN0. :1、2、3或4,0. 8mg/mL)，质控线（C线）为鼠抗BSA单抗 (1. 0mg/mL)，干燥后以封闭液1%0VA(卵清蛋白）0? 01m〇l/LPBS封闭2小时；用0? 01m〇l/L PBS洗涤3次，真空干燥后切成0. 4cmX6. 0cm的测试条。
[0178] 4. 4试剂盒的组装
[0179] 将上述免疫层析测试条置于塑料盒内，加样孔对准检测条样品垫位置，压紧后组 装成可卡因检测试剂盒，加入干燥剂密封保存。
[0180] 4. 5检测盒检测原理
[0181] 如图6所示，本实施例主要采用核酸适体和层流检测技术。即尿样中的可卡因与 胶体金标记的（C0C-BSA)竞争性地与固相于硝酸纤维膜上的可卡因核酸适体结合，通过观 察窗检测区（T)位置有无紫红色带进行判断检测结果。无论样品中有无可卡因成分，胶体 金标记的（COC-BSA)都会与质控区抗BSA抗体相结合，形成一条C线。
[0182] 4. 6结果判断
[0183] 从密封袋中取出试剂盒，用塑料吸管垂直滴加3滴样本（尿样、唾液、血样等约 120yl)于加样孔内，在5分钟时间内读取检测结果（见图6)。
[0184] 阳性（+):仅在质控区（C)出现一条紫红色带，在检测区"T"位置均未出现紫红色 带，说明可卡因为阳性。阳性结果表明：样品中可卡因浓度均在检测阈值之上。
[0185] 阴性:如在质控区（C)出现一条紫红色带，仅在检测区"T"出现的紫红色带， 说明可卡因为阴性。阴性结果表明：可卡因浓度均在检测阈值之下。检测区（T)的紫红色 带可显现出颜色深浅的现象，在规定的观察时间内，无论该色带颜色深浅，应判定为阴性结 果。阴性结果表明：可卡因浓度均在检测阈值之下。
[0186] 无效：本设计的质控区（C)有两个目的，一是无论样本中是否含有毒品成分，胶体 金标记的（C0C-BSA)总能与固相于质控区（C)硝酸纤维素膜上的鼠抗BSA抗体结合，在质 控区（C)处形成一条紫红色带，该色带是样本阳性或阴性的指示线。二是指示检测过程是 否正常和试剂盒是否变质的标准。若质控区（C)没有出现色带，无论T线位置是否出现色 带，检测结果均为无效，应重新换取试剂盒检测。
[0187] 实施例5
[0188] 核酸适体的特异性
[0189] 选用的交叉反应物质为甲基苯丙胺、苯丙胺、MDMA、MDA、吗啡、可待因、海洛因、福 尔可定、单乙酰吗啡、二氢可待因、二氢埃托菲、雷米替丁、哌替啶、芬太尼、曲马多、右丙氧 芬、纳洛酮、纳曲酮、烯丙吗啡、可乐宁、洛非西丁、东莨菪碱、益安口服液、正通宁片、扑热息 痛、阿斯匹林、布洛芬、阿米替林、丙米嗪、氯丙嗪、异丙嗪、水合氯醛、安定、三唑仑、阿普唑 仑、苯巴比妥、速可眠、异戊巴比妥、咖啡因、氟哌酸、先锋IV、黄连素、乳糖、普鲁卡因、康复 新胶囊、水合氯醛、奥复沙星、非那西丁、去痛片、氯胺酮、去甲基氯胺酮、美沙酮、度冷丁、麻 黄素、左旋麻黄素、右旋麻黄素、蒂巴因、四氢大麻酚、利多卡因、那可丁、丁丙诺啡、苯丙醇 胺和苯乙胺共64种药品和毒品。
[0190] 将上述检测物质配制成一定浓度的溶液，用实施例4所述的试剂盒进行检测。
[0191] 结果表明：核酸适体检测试剂（SEQIDN0. :1-4)都仅与可卡因发生反应，与其 他物质没有交叉反应，可卡因核酸适体检测试剂盒具有特异性强、准确可靠的性能。
[0192] 实施例6
[0193] 核酸适体的灵敏度
[0194] 灵敏度测试：在空白尿样中添加可卡因，分别配制成一系列梯度浓度（1.0~ 2000.Ong/mL)的溶液来测试可卡因试剂盒。
[0195] 结果如图7所示，本发明核酸适体的可卡因的最低检测灵敏度均为10.Ong/mL以 下。与胶体金标记可卡因单克隆抗体的免疫检测试剂盒相比，其灵敏度高出5倍。
[0196] 实施例7
[0197] 检测阈值的确定
[0198] 为了区别正常医用量和吸毒量，通过调节试剂条上标记的C0C-BSA的用量，将可 卡因的检测阈值调节至300.Ong/mL。
[0199] 实施例8
[0200] 核酸适体检测的准确性
[0201] 将实施例4所述的核酸适体可卡因试剂盒与GC-MS检测结果的对比，结果见表1。 结果表明，本发明试剂盒的准确性达到100%。
[0202] 表1检测准确性
【主权项】
1. 一种核酸适体，其特征在于，所述的适体特异性结合于可卡因； 并且，所述的特异性结合指所述适体结合于可卡因但不结合于以下任何一种物质：甲 基苯丙胺、苯丙胺、MDMA、MDA、吗啡、可待因、海洛因、福尔可定、单乙酰吗啡、二氢可待因、 二氢埃托菲、雷米替丁、哌替啶、芬太尼、曲马多、右丙氧芬、纳洛酮、纳曲酮、烯丙吗啡、可乐 宁、洛非西丁、东莨菪碱、益安口服液、正通宁片、扑热息痛、阿斯匹林、布洛芬、阿米替林、丙 米嗪、氯丙嗪、异丙嗪、水合氯醛、安定、三唑仑、阿普唑仑、苯巴比妥、速可眠、异戊巴比妥、 咖啡因、氟哌酸、先锋IV、黄连素、乳糖、普鲁卡因、康复新胶囊、水合氯醛、奥复沙星、非那西 丁、去痛片、氯胺酮、去甲基氯胺酮、美沙酮、度冷丁、麻黄素、左旋麻黄素、右旋麻黄素、蒂巴 因、四氢大麻酚、利多卡因、那可丁、丁丙诺啡、苯丙醇胺和苯乙胺。
2. 如权利要求1所述的核酸适体，其特征在于，所述的适体的序列如SEQ ID NO. :1、2、 3、或4所示。
3. -种偶联物，其特征在于，所述偶联物包括权利要求1所述的核酸适体以及与所述 核酸适体相连的可检测标记物。
4. 如权利要求3所述的偶联物，其特征在于，所述的可检测标记物包括生物素、化学发 光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、胶体金、放射性同位素、乳胶颗粒、抗体、配体、抗原、 受体、或其组合。
5. -种复合物，其特征在于，所述的复合物是（a)权利要求1所述的核酸适体或权利要 求3所述的偶联物与（b)可卡因所形成的复合物。
6. -种检测制品，其特征在于，所述检测制品含有权利要求1所述的核酸适体或权利 要求3所述的偶联物。
7. 如权利要求6所述的检测制品，其特征在于，所述的检测制品包括：检测试剂、侧流 片、芯片、测试条、检测板。
8. -种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含权利要求1所述的核酸适体，权 利要求3所述的偶联物和/或权利要求6所述的检测制品。
9. 如权利要求1所述的核酸适体或权利要求3所述偶联物的用途，其特征在于，用于制 备检测可卡因的检测制品或试剂盒。
10. -种检测可卡因的方法，包括以下步骤： (a) 提供待检测的样品； (b) 将该样品与权利要求1所述的核酸适体或权利要求3所述的偶联物混合，形成混合 物； (c) 检测所述混合物中"可卡因-核酸适体复合物"的存在与否，其中如果存在所述复 合物，则表明所述样品中存在可卡因；如果不存在所述复合物，则表明所述样品中不存在可 卡因。
【专利摘要】本发明提供了可卡因核酸适体、检测试剂盒及其应用。具体地，本发明人采用SELEX技术，基于特殊结构的ssDNA文库，成功地筛选得到对可卡因有高亲和力和特异性的核酸适体。本发明的适体可应用于现场快速、灵敏地检测可卡因。
【IPC分类】G01N33-53, C12N15-115
【公开号】CN104745586
【申请号】CN201310743132
【发明人】曾立波, 张玉荣, 陈连康, 胡小龙
【申请人】上海市刑事科学技术研究院
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年12月27日