10.0)，37°C保温 2min，加入同样 温度的底物（用25mmol/L的Tris-HCl, 10mmol/LCaC12,10%甘油，pH10. 0的缓冲液配制 的 0? 5mmol/L的suc-AAPF-pNa)400yL，于 37°C反应 10min，加入 500yL10% 的三氯乙酸 终止反应，静置离心，测定吸光度A41(l，以提前灭活的反应体系为空白对照，通过已绘制的标 准曲线计算酶活力。规定在37°C，pH10. 0的条件下，每分钟水解底物suc-AAPF-pNa释放 出1ymolpNP所需要的酶量为1个酶活力单位（U)。
[0042] 5、本发明还分别对该重组酶的最适反应pH值、最适作用温度、热稳定性以及不同 金属离子对酶活的影响进行了检测，结果显示：该酶的最适pH值为10. 0左右，最适作用温 度在36~38°C之间，在30°C条件下酶活仍保持在最高酶活的80%以上，当反应温度超过 38°C时，随着温度的升高，酶活力逐渐下降，当温度达到50°C以上时，酶活基本丧失；酶的 热稳定性研宄表明：重组蛋白酶在l〇°C条件下比较稳定，保温2h后酶活仍能达到90%以 上，37C保温lh后，残余酶活为60 %左右，45C保温30min，残留酶活为37%，保温lh后，残 余酶活仅为15% ;因此属于典型的低温碱性蛋白酶。不同的金属离子对酶活也有一定的影 响；金属离子Ca2+对该重组蛋白酶有激活作用，Mn2+对酶活基本没有影响；Mg2+、Ba2+、Fe3+、 Zn2+、C〇2+、Zn2+则对其有一定的抑制作用，Ni2+对其抑制作用最强，浓度为1. 0mm〇l/L的Ni2+ 可抑制90%以上的酶活。
[0043] 以下对上述步骤进行详细说明。
[0044] 实施例1 :
[0045] cp 1 s8全基因的克隆
[0046] 根据菌株分类鉴定及蛋白测序结果，设计了兼并性引物：
[0047] cpls8Fl :5' -CGAATTRTWGGTGGGAAAAACT-3'
[0048] cpls8Rl :5' -TGYGGYGTYGCCATTGAAGT-3'
[0049] 提取海洋细菌Planococcussp. 11815基因组，并以其为模板，采用PCR的方式扩 增出cpls8基因中565bp的一段保守区。PCR扩增条件为：95°C5分钟，95°C30秒，55°C30 秒，72°C1分钟，30个循环，72°C延伸5分钟。根据对该保守区的测序及分析比对结果，重新 设计反向引物：
[0050]cpls8F2 :5' -GATTATAACGGGCATGGCACC-3'
[0051]cpls8R2 :5' -CCGGACAGACTGGCATATTTC-3
[0052] 用MboI部分酶切Planococcussp. 11815基因组DNA，电泳分离并回收2~3kb的 酶切片段，16°C连接环化，然后以此为模板，用反向引物cpls8F2和cpls8R2扩增出约600bp 的条带，经胶回收及测序后，与已知的保守区拼接成完整的序列。反向PCR条件为：95°C5 分钟，95°C30秒，50~55°C30秒，72°C1分钟，30个循环，72 °C延伸5分钟。
[0053] 实施例2:
[0054]cpls8全基因的序列分析
[0055]DNA序列分析比对及开放阅读框的定位使用NCBI网站的Blast和ORFFinder工 具，蛋白分类及功能分析使用http://merops.sanger.ac.uk/，启动子及表达调控序列预测 米用http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/ 的Promoter2.OPredictionServer 工具。
[0056] 实施例3 :
[0057]cpls8基因在大肠杆菌E.coliRosetta(DE3)中的表达
[0058] 根据克隆基因cpls8的ORF区序列，分别设计了上下游引物cpls8F_NdeI和 cpls8R-Xh〇I，并在该引物的末端添加了NdeI和XhoI限制性酶切位点。
[0059] cpls8F_NdeI :
[0060] 5' -GGGAATTCCATATGAAAAATATTCATTTGATTCCATACCGC-3,
[0061] cpls8R-Xho I：
[0062] 5, -CCGCTCGAGCCGGTCCAATCCATTAGCATAAGA-3,
[0063] 以Planococcussp. 11815的基因组为模板，采用PCR的方式扩增出cpls8的开放 阅读框（〇RF) (PCR条件为：95°C5分钟，95°C30秒，55°C30秒，72°C1分钟，30个循环，72°C 延伸5分钟），回收PCR产物，并利用NdeI和XhoI限制性酶切位点将其克隆至表达载体 pET22b上得到表达载体pET22b-cpls8,该基因所表达的氨基酸序列与载体上的组氨酸标 签形成融合蛋白。将表达载体pET22b-cpls8转化至菌株E.coliRosetta(DE3)中，接种于 带氨苄青霉素的LB培养基中，200rpm，37°C震荡培养，待0D600为0? 6~1. 0时，加入终浓 度为0. 5mM的IPTG诱导6小时，收集菌体，重悬于Tris-HCl缓冲液中（25mmol/LTris-HCl 缓冲液，10臟〇1/10&(：12，10%甘油，？118.0)，超声破碎，离心，取上清，进行303^^6￡检测。
[0064] 实施例4 :
[0065] 重组蛋白CPLS8的分离纯化
[0066] ⑴收集并破碎菌体：将收集的菌体（菌体湿重约0. 5g)重悬于10mLBinding Buffer(25mmol/LTris-HCl缓冲液，10mmol/LCaCl2，10%甘油，pH8.0)中，超声破碎，离 心，取上清，并用0. 45mm的滤膜过滤，取滤液待用。
[0067]⑵平衡Ni2+-NTA柱：用 5 ~10 倍株床体积的BindingBuffer(25mmol/LTris-HCl 缓冲液，10mm〇l/LCaCl2,10%甘油，pH8. 0)洗涤平衡Ni2+-NTA柱，流速 0? 5 ~lmL/min。
[0068] ⑶样品上柱：将细胞裂解所获得的上清液以0. 5mL/min的流速，流经Ni2+-NTA柱； 待样品完全挂柱后，再用2倍柱床体积的BindingBuffer(25mmol/LTris-HCl缓冲液， 10mmol/LCaCl2，10%甘油，pH8. 0)冲洗Ni2+-NTA柱，去除未挂柱的杂蛋白。
[0069] ⑷CPLS8的分离纯化：分别采用含有不同浓度咪唑（20mM、40mM、60mM、80mM、 100mM、200mM)的缓冲液（25mMTris-HCl缓冲液，lOmmol/LCaC12，10%甘油，pH8.0)对挂 柱蛋白进行分步洗脱，各收集组分经SDS-PAGE检测后，获得纯化的重组蛋白CPLS8。
[0070] 实施例5 :
[0071] 重组酶CPLS8酶学性质的研宄
[0072] ⑴最适反应温度的测定：在不同温度（4°C、10°C、20°C、25°C、30°C、37°C、40°C、 45°C、50°C)和pH10. 0的条件下，测定低温蛋白酶CPLS8的酶活，将最高酶活定为100%， 其他温度下的酶活与最高酶活的比值即为待测酶液在该温度下的相对酶活。
[0073] 结果表明：该酶的最适作用温度在36~38°C之间，在30°C条件下酶活仍保持在最 高酶活的80%以上，当反应温度超过38°C时，随着温度的升高，酶活力逐渐下降，当温度达 到50°C以上时，酶活基本丧失。
[0074] ⑵热稳定性的测定：将酶置于10°C、37°C、45°C的条件下保温2h，每隔一定时间取 样在37°C、pH10. 0的条件下测定测残余酶活，在4°C条件下保存的待测酶的酶活力定为 100%，绘制温度稳定性曲线。
[0075] 结果表明：重组蛋白酶在10°C条件下比较稳定，保温2h后酶活仍能达到90%以 上，37C保温lh后，残余酶活为60 %左右，45C保温30min，残留酶活为37%，保温lh后，残 余酶活仅为15% ;因此属于典型的低温碱性蛋白酶。
[0076] ⑶最适pH的测定：用不同pH值的磷酸盐缓冲液（pH2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、6. 5、 7. 0、8. 0、9. 0、10. 0、10. 5、11. 0)将待测酶液进行适当的稀释，在37°C及相应pH条件下测定 酶活，酶活数值最大者计为100%，所对应的pH即为待测酶最适反应pH，其他pH下的单位 酶活与最高值的比值即得出其相对酶活。
[0077] 结果表明：该酶的最适作用pH为10. 0左右，当pH值升至11时，仍能保持最高酶 活的80 %左右；当pH值降至7. 0以下时，则酶活迅速降低，因此该酶属于典型的碱性蛋白 酶。
[0078] ⑷金属离子和其他抑制剂等对酶活的影响：将待测酶液置于各种金属离子（Ca2+， Mg'CdCo'Zn'Itf^Ba2.，1. 0 ~5.Ommol/L)缓冲液中 4。。保温lh，在pH10. 0,37°C 条件下测定残留的酶活。
[0079] 结果表明：金属离子Ca2+对该重组蛋白酶有激活作用，Mn2+对酶活基本没有影响； Mg2+、Ba2+、Fe3+、Zn2+、Co2+、Zn2+则对其有一定的抑制作用，Ni2+对其抑制作用最强，浓度为 1. 0mmol/L的Ni2+可抑制90%以上的酶活。
[0080] 表1:不同的金属离子对CPLS8酶活的影响.
[0081]
【主权项】
1. 一种新型低温蛋白酶编码基因，其特征在于：所述基因序列见序列1。
2. -种新型低温蛋白酶，其特征在于：由权利要求1所述的基因编码，其氨基酸序列见 序列2。
3. -种产新型低温蛋白酶的基因工程菌，其特征在于：包括权利要求1所述的基因。
4. 根据权利要求3所述的产新型低温蛋白酶的基因工程菌，其特征在于：所述工程菌 的宿主菌为 E.coli Rosetta(DE3)。
5. 根据权利要求3所述的产新型低温蛋白酶的基因工程菌，其特征在于：所述工程菌 的载体为 pET22b-cpls8。
6. 权利要求3所述的基因工程菌发酵获得的低温蛋白酶。
7. 根据权利要求6所述的低温蛋白酶，其特征在于：所述酶最适催化pH值为10,最适 催化温度为37±5°C，在20~30°C之间保持最高酶活的50%以上。
【专利摘要】本发明涉及一种新型低温蛋白酶编码基因及其在大肠杆菌中的功能表达，本发明从动性球菌Planococcus sp.11815中克隆到一段新型低温蛋白酶编码基因cpls8，序列分析表明：该基因所编码的蛋白序列共含有329个氨基酸残基，属S8家族丝氨酸蛋白酶，与目前数据库中已发表蛋白序列的最高源性仅为77％。该基因在E.coil Rosseta(DE3)实现了功能表达，酶学性质分析表明：其最适催化pH值为10，最适催化温度为37℃左右，在20～30℃之间可保持最高酶活的50％以上，因此属典型的低温碱性蛋白酶，在洗涤、食品、医药等领域具有广泛的应用前景。CGMCC No.808820130829
【IPC分类】C12N15-57, C12R1-19, C12N1-21, C12N9-52
【公开号】CN104745614
【申请号】CN201510104041
【发明人】路福平, 张会图, 莫清珊
【申请人】天津科技大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月10日