具有抗氧化活性的小肽、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及具有抗氧化活性的小肽、制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 自由基理论被提出后，许多研宄结果都显示自由基与人类多种疾病和衰老的发生 有关，如动脉粥样硬化、血栓、心肌缺血再灌注损伤、糖尿病、癌症和神经退行性疾病等。活 性氧（ROS)是一种广泛存在于人体中的自由基，由线粒体产生，包括超氧阴离子自由基、羟 基自由基等，它们会损伤线粒体DNA、酶和I吴脂质，从而引起各种疾病的发生。抗氧化剂具有 捕获和中和自由基的能力，当机体中的自由基产生过多而超出清除能力的范围时，通过补 充抗氧化剂可以清除多余的自由基，维持体内自由基平衡，可以有效预防多种自由基引起 的疾病。人工合成的抗氧化剂如BHA、BHT、PG、TBHQ等，是多种食品的添加剂，它们能延缓 或阻止食品中的油脂酸败、蛋白质变性，提高食品的稳定性、延长储藏期。但长期服用会伤 害人体的肝、脾、肺，具有蓄积性致癌作用，影响与呼吸相关的酶的活性，人工抗氧化剂的应 用因此受到了限制。从动物和植物中寻找具有抗氧化活性的天然物质是解决这一问题的关 键，且天然抗氧化剂具有安全、高效、来源广泛的特点。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种具有较强抗氧化活性的小肽，来源于麦胚清蛋白，具有 安全、高效、来源广泛的特点。
[0004] 本发明的另一目的是提供上述小肽的制备方法，该方法简单，安全，高效，重复性 好。
[0005] 本发明的再一目的是提供上述小肽在提高食品的稳定性、延长食品储藏期或者制 备具有抗氧化活性的保健食品方面的应用。
[0006] 本发明的目的采用如下技术方案实现。
[0007] -种具有抗氧化活性的小肽，氨基酸序列为AREGETVVPG，如SEQIDNO: 1所示。
[0008] 本发明还提供所述小肽的制备方法，包括如下步骤：
[0009] (1)将麦胚清蛋白采用胰蛋白酶酶解，得到清蛋白水解产物I;
[0010] (2)取所述清蛋白水解产物I中分子量小于IOKDa的组分，采用凝胶过滤色谱分 离，取具有抗氧化活性的组分作为清蛋白提取物II;
[0011] (3)将所述清蛋白提取物II采用碱性蛋白酶酶解，得到清蛋白水解产物III;
[0012] (4)将所述清蛋白水解产物III依次采用凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱分离， 得到所述小肽。
[0013] 优选的技术方案中，步骤（2)中所述凝胶过滤色谱中的凝胶填料为Sephadex G-75,流动相为水。
[0014] 优选的技术方案中，步骤（4)中所述凝胶过滤色谱中的凝胶填料为Sephadex G-15,流动相为水，取具有抗氧化活性的洗脱液。
[0015] 优选的技术方案中，步骤（4)中所述反相高效液相色谱中使用WatersXBridgeTM pr印C18色谱柱，洗脱程序为：0~lOmin，流动相AlOO~85%线性降低，流动相BO~15% 线性升高；10~15min，流动相A85~80 %线性降低，流动相B15~20 %线性升高；收集对 应于流动相B体积浓度为15. 8~16%时的洗脱液，即得所述小肽；所述流动相A是浓度为 0. 05-0. 15%三氟乙酸的水溶液，流动相B是浓度为0. 05-0. 15%三氟乙酸的乙腈溶液。
[0016] 步骤（1)中所述麦胚清蛋白优选采用如下方法获得：采用水提取脱脂麦胚粉中的 清蛋白，加入硫酸铵至饱和度为70 % -80 %，搅拌，离心取沉淀。
[0017] 优选的技术方案中，所述胰蛋白酶酶解过程中，每克清蛋白中加入6000-8000U胰 蛋白酶，酶解温度为36. 5-37. 5,酶解pH7. 0-8. 0,酶解时间5-7h。
[0018] 优选的技术方案中，步骤（3)中碱性蛋白酶酶解过程中，每克蛋白中加入碱性蛋 白酶0? 1-0. 2AU，酶解温度45-55°C，酶解pH7. 5-8. 5,酶解时间L0-2.Oh。
[0019] 本发明还要求保护所述小肽在提高食品的稳定性、延长食品储藏期或者制备具有 抗氧化活性的保健食品方面的应用。
[0020] 本发明小肽，具有较强的抗氧化活性，来源于麦胚清蛋白，是理想的天然抗氧化 剂，具有安全、高效、来源广泛、价格低廉的特点。该小肽可以应用于提高食品的稳定性、延 长食品储藏期；或者制成具有抗氧化活性的保健食品，为人体的健康和疾病的预防提供更 多的选择。
[0021] 本发明将麦胚清蛋白进行酶解后，巧妙选择了超滤和色谱法从组分众多、成分复 杂的蛋白水解物中分离到了具有抗氧化活性的小肽。该方法简单，安全，高效，重复性好。
【附图说明】
[0022] 图1为S印hadexG-75分离图谱。
[0023] 图2为S印hadexG-15分离图谱。
[0024] 图3为RP-HPLC分离图谱，其中横坐标为保留时间，纵坐标为响应值（单位mAU)。
[0025] 图4为洗脱液P3中活性组分的的TIC图，其中横坐标为保留时间，纵坐标为峰高。
[0026] 图5为洗脱液P3中活性组分的二级质谱图，其中横坐标表示离子的质荷比（m/z) 值，纵坐标表示离子流的强度。
[0027] 图6为洗脱液P3中活性组分对细胞内ROS的影响，其中横坐标为不同的处理，纵 坐标为ROS的量。
【具体实施方式】
[0028] 实施例1制备具有抗氧化活性的小肽
[0029] (1)麦胚清蛋白的提取：准确称取脱脂麦胚粉100g，加入1000 ml去离子水，混合均 匀，在40°C水浴中搅拌提取Ih;8000rpm离心30min，取上清液缓慢加入硫酸铵至饱和度为 75%，4°C下搅拌2h;12000rpm离心20min，弃去上清，收集沉淀，该沉淀即为麦胚清蛋白。为 了进行后续的纯化，将麦胚清蛋白透析除盐、冷冻干燥获得麦胚清蛋白粉。
[0030] (2)胰蛋白酶酶解：用pH7. 6、浓度0.IM的磷酸盐缓冲液溶解麦胚清蛋白粉，每克 蛋白加入7000U胰蛋白酶（购自上海生工生物工程有限公司，2500000U/g)，在37°C下酶解 6h，得到清蛋白水解产物I。pH7. 6、浓度0.IM的磷酸盐缓冲液：取86. 6ml的磷酸氢二钾 (IM)溶液和13. 4ml的磷酸二氢钾（IM)溶液混合均匀并定容到1L。
[0031] (3)清蛋白水解产物I的分离纯化：①超滤膜法：将截留分子量为IOKDa超滤膜安 装在超滤装置上，去离子水清洗；清蛋白水解产物I用pH7. 6、0.IM磷酸盐缓冲液稀释至质 量百分浓度为〇? 1%后上样；调节泵的压力使进口端压力不超过20psi，出口端的压力不超 过30psi进行超滤。超滤后收集滤过液，其中含有分子量小于IOKDa的组分。将分子量小于 IOKDa的组分除盐并冷冻干燥，获得冻干粉。②凝胶过滤色谱法：S印hadexG-75干粉（购 自美国GE公司）用去离子水充分溶胀，利用重力沉降原理装填入2. 5*75cm层析柱中，去离 子水平衡；将①得到冻干粉溶于去离子水配成质量百分浓度为2 %的溶液，经0. 22ym的滤 膜过滤除去颗粒物，采用S印hadexG-75凝胶柱分离，上样量为柱体积的5% ;去离子水洗 脱，流速为30ml/h，检测波长220nm，每IOmin收集一管洗脱液，收集液冷冻干燥，测抗氧化