活性。分离色谱图如图1所示。经测定，对应于保留时间6. 5h~8. 25h的洗脱液具有抗氧 化活性，将该洗脱液作为清蛋白提取物II，冷冻干燥，获得冻干粉。
[0032] (4)碱性蛋白酶酶解：将清蛋白提取物II冻干粉溶于pH8. 0、浓度0.IM的磷酸盐缓 冲液，每克蛋白中加入〇. 15AU碱性蛋白酶（购自诺维信公司，2. 4AU/ml)酶解，在50°C下酶 解I. 5h，得到清蛋白水解产物III，冷冻干燥得到冻干粉。
[0033] (5)清蛋白水解产物III的分离纯化：①凝胶过滤色谱法：SephadexG-15干粉（购 自美国GE公司）用去离子水充分溶胀，利用重力沉降原理装填入I. 5*60cm层析柱中，去 离子水平衡；清蛋白水解产物III冻干粉溶于去离子水配成质量百分浓度为2%的溶液，经 0. 22ym的滤膜过滤除去颗粒物，采用SephadexG-15凝胶柱分离，上样量为柱体积的3%; 去离子水洗脱，流速为30ml/h，检测波长220nm，每IOmin收集一管洗脱液，收集液冷冻干 燥，测抗氧化活性。分离色谱图如图2所示。对应于保留时间I. 5h~2. 5h的洗脱液具有 抗氧化活性，收集该洗脱液冷冻干燥后进行下一步纯化。②制备型RP-HPLC法：将Sephadex G-15凝胶柱分离到的组分采用反相高效液相色谱法分离。选用WatersXBridgeTMprep C18色谱柱（购自美国Waters公司），流动相A是是体积百分浓度为0.I%TFA(三氟乙酸） 的去离子水溶液，流动相B是体积百分浓度为0. 1%TFA(三氟乙酸）的乙腈溶液。
[0034] 洗脱程序为：0~lOmin，流动相AlOO~85 %线性降低，流动相BO~15 %线性升 高；10~15min，流动相A85~80%线性降低，流动相B15~20%线性升高。检测波长为 214nm，柱温为25°C。分离图谱如图3所示。收集对应于流动相B体积浓度为15. 8~16% 的洗脱液P3,其抗氧化活性最高，进行进一步的结构鉴定。
[0035] (6)结构鉴定：采用LC-MS/MS检测反相高效液相色谱色谱法中洗脱液P3中的活 性组分纯度及氨基酸序列。将待测样品溶于去离子水配制成浓度为20yg/ml的蛋白溶液。 流动相A为0.1% (质量百分浓度）甲酸的水溶液，B为0.1% (质量百分浓度）甲酸的乙 腈溶液，选用BEHC18色谱柱柱。洗脱程序为：0-5min，流动相AlOO~85%线性降低，流动 相BO~15%线性升高；5~lOmin，流动相A85~100%线性升高，流动相B15%~0线性降 低。样品经过液相色谱分离系统后，再由质谱系统将肽段打成不同分子量的碎片，并由质量 分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器检测得到质谱图，实验结果如图4-5。分析质谱 图，发现洗脱液P3中的活性组分为氨基酸序列为AREGETVVPG的小肽，分子量为1014. 52Da。 洗脱液P3的冻干粉中该小肽的纯度为85%。
[0036] (7)测定小肽AREGETVVPG的抗氧化活性
[0037] ①采用DPPH法测样品的抗氧化活性，方法步骤为：准确称量DPPH(1，1_二苯 基-2-三硝基苯肼，购自美国Sigama公司）0. 0046g，用无水乙醇溶解后定容到100ml，配成 0. 12mM的DPPH溶液；待测样品稀释成不同浓度，将Iml待测样品和ImlDPPH溶液混合均 匀，25 °C下避光反应30min，反应结束后在517nm波长下测定吸光值Ai。实验需设置空白组 和对照组。其中，空白组中以水替代样品，其他步骤同样品检测方法，得到吸光值Atl;对照组 中以无水乙醇替代DPPH溶液，其他步骤同样品检测方法，测定吸光值Aj。每组设置3个平 行，按如下公式计算清除率：
[0038]
【主权项】
1. 一种具有抗氧化活性的小肽，氨基酸序列为aregetvvpg。
2. 权利要求1所述小肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 将麦胚清蛋白采用胰蛋白酶酶解，得到清蛋白水解产物I; (2) 取所述清蛋白水解产物I中分子量小于IOKDa的组分，采用凝胶过滤色谱分离，取 具有抗氧化活性的组分作为清蛋白提取物II; (3) 将所述清蛋白提取物II采用碱性蛋白酶酶解，得到清蛋白水解产物III; (4) 将所述清蛋白水解产物III依次采用凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱分离，得到 所述小肽。
3. 根据权利要求2所述制备方法，其特征在于步骤（2)中所述凝胶过滤色谱中的凝胶 填料为SephadexG-75,流动相为水。
4. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于步骤（4)中所述凝胶过滤色谱中的凝胶 填料SephadexG-15,流动相为水，取具有抗氧化活性的洗脱液。
5. 根据权利要求4所述制备方法，其特征在于步骤（4)中所述反相高效液相色谱中 使用WatersXBridgeTMprepC18色谱柱，洗脱程序为：0~lOmin，流动相A100~85% 线性降低，流动相B0~15 %线性升高；10~15min，流动相A85~80 %线性降低，流动 相B15~20 %线性升高；收集对应于流动相B体积浓度为15. 8~16 %时的洗脱液，即 得所述小肽；所述流动相A是浓度为0. 05-0. 15 %三氟乙酸的水溶液，流动相B是浓度为 0. 05-0. 15%三氟乙酸的乙腈溶液。
6. 根据权利要求5所述制备方法，其特征在于步骤（1)中所述麦胚清蛋白采用如下方 法获得：采用水提取脱脂麦胚粉中的清蛋白，加入硫酸铵至饱和度为70 % -80 %，搅拌，离 心取沉淀。
7. 根据权利要求6所述制备方法，其特征在于所述胰蛋白酶酶解过程中，每克清蛋白 中加入6000-8000U胰蛋白酶，酶解温度为36. 5-37. 5,酶解pH7. 0-8. 0,酶解时间5-7h。
8. 根据权利要求7所述制备方法，其特征在于步骤（3)中碱性蛋白酶酶解过程中， 每克蛋白中加入碱性蛋白酶〇. 1-0. 2AU，酶解温度45-55°C，酶解pH7. 5-8. 5,酶解时间 1. 0~2, 0h〇
9. 权利要求1所述小肽在提高食品的稳定性、延长食品储藏期或者制备具有抗氧化活 性的保健食品方面的应用。
【专利摘要】本发明提供具有抗氧化活性的小肽、制备方法及其应用，属于生物技术领域。该小肽的氨基酸序列为AREGETVVPG。该小肽的制备方法包括：将麦胚清蛋白采用胰蛋白酶酶解，得到清蛋白水解产物Ⅰ；取所述清蛋白水解产物Ⅰ中分子量小于10KDa的组分，采用凝胶过滤色谱分离，取具有抗氧化活性的组分作为清蛋白提取物Ⅱ；将所述清蛋白提取物Ⅱ采用碱性蛋白酶酶解，得到清蛋白水解产物Ⅲ；将所述清蛋白水解产物Ⅲ依次采用凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱分离，得到所述小肽。本发明小肽具有较强抗氧化活性，来源于麦胚清蛋白，具有安全、高效、制备方法简单重复性好的特点，可以应用于提高食品的稳定性、储藏期或制备具有抗氧化活性保健食品。
【IPC分类】C07K7-06, C12P21-06, C07K1-20, C07K1-16, A23L1-305, A23L3-3544
【公开号】CN104788541
【申请号】CN201510228999
【发明人】沈新春, 陈思远, 刘永祥, 曹小舟, 苏安详, 俞凌
【申请人】南京财经大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年5月7日