CAACCGAACCNGCVAGVNNVNNVAANCCCTGGCGGATGAGGTAGGCGC CG
[0050] JPS/LAF-P10F ：GCATTAAAAAGCCGTCGTNACVNGVNNNTGVNNVNNGTGGATATCGCCGTACCGCG CG
[0051] JPS/LAF-PI IF ：CCGCATAATCGAAATTAATANNNNNNNNTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAAC
[0052] JPS/LAF-PI2F:GTATATTAGTTAAGTATAAGRRRRRRDDDDDDATGAAACCCGACGCACACCAGG
[0053] JPS/LAF-P13F ： CATCGCCCGGAACTTGCCNGGVNNVNNNNCGAGGCGATGGGCGTTTCACTG
[0054] JPS/LAF-P14F ：TTCTATGGTTTTGAAGAAGATNCTNNTNNNNNGNATCGCACCGCCCGTGACCTGTG CC
[0055] JPS/LAF-P 15F ：GGCGTTAAGTGAGTTTATTAAGGTCAGGGATTGGGTGTAAGCACTTCGTGGCCGAG CTCG
[0056] JPS/LAF-ELF:TGTTTAACTTTAATAAGGAGGGATCC
[0057] JPS/LAF-ELR:CGAGCTCGGCCACGAAGTGC
[0058] PRSFDUET-F:GCACTTCGTGGCCGAGCTCGAGTCTGGTAAAGAAACCGCTGC
[0059] PRSFDUET-R:CTCCTTATTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTACAG
[0060] 编辑引物为JPS/LAF-P1F至JPS/LAF-P14F，其中JPS/LAF-P1F兼具锚点引物的功 能，JPS/LAF-P15F为另一条锚点引物，JPS/LAF-ELF和JPS/LAF-ELR引物为整个突变改造后 的代谢途径的外端引物，PRSFDUET-F和PRSFDUET-R为制备用于重组表达代谢途径的载体 引物。
[0061] 在25 μ 1反应体系中：2. 5 μ I IOx反应缓冲液，上游锚点引物JPS/LAF-P1F、磷酸 化的下游锚点引物JPS/LAF-P15F和磷酸化的编辑引物JPS/LAF-P1F至JPS/LAF-P14F适量 (根据磷酸化体系计算，每条编辑引物l_5pmol)，DNA模板加入量约10-50ng (与引物比例为 1:100)，上游外端引物JPS/LAF-ELF、下游外端引物JPS/LAF-ELR分别加入相对于下游锚点 引物 2 倍的量，加入 Phusion DNA polymerase (NEB) 0.5 μ 1，Ampligase (EPI)连接酶 1 μ 1〇 混匀后按如下 PCR 程序运行：94°C 2min，[94°C 30s，50°C lmin，66°C 5min]x32,72°C 5min， 4°C hold on。PCR产物为突变体文库，以1%琼脂糖凝胶电泳切胶回收。采用凝胶回收试剂 盒按说明书推荐方法回收PCR产物。PRSFDUET-F和PRSFDUET-R为制备用于重组表达代谢 途径的载体引物。构建的代谢途径突变文库采用同源重组技术克隆进入PRSFDuet-I质粒， 转化BL21DE3表达宿主，突变含有50ng/ml卡那霉素的LB固体平板，37°C培养过夜。采用 高通量培养技术，随机挑取2400个单克隆接种于含有无机盐培养基的96孔培养板，培养基 成分（g L-1) :pH 7. 0、葡萄糖 20. 0、酵母浸膏 2. 0、（NH4)2S0416. 0, ΚΗ2Ρ043· 0, Na2HPO4 · 12H20 16. 0, MgSO4 ·7Η20 I. 0, MnSO4 · H2O 0. 01.添加 50ng/ml 卡那霉素和终浓度为 0.1 mM 的 IPTG 诱导剂。37°C 220rpm培养36h。发酵液上清离心后，适当稀释，测定ALA发酵产量。
[0062] ALA检测方法是：将样品稀释至2mL，加入ImL的乙酸盐缓冲液，0. 5mL的乙酰 丙酮，然后煮沸15min。冷却至室温，取2mL的反应液至新管中，然后加入2mL的改良 Ehrlich's试剂，反应20min，利用分光光度计554nm下检测。本发明中采用批量96孔板测 定方法，相应试剂使用量按相同比例减少体积。
[0063] 根据产量测定结果显示（如附图3所示），重组的原质粒克隆ALA产量仅为IlOmg/ L，而从突变文库中筛选获得了明显提高ALA产量的突变菌株，最高的ALA产量到1930mg/L， 提高了近17倍。由此说明，本发明对于产物代谢途径的体外改造具有明显的作用。
[0064] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种进化代谢途径的方法，其特征在于，主要包括制备单链突变体文库、制备双链 突变体文库、筛选突变体，单链突变体文库与双链突变体文库分步或同时构建；为构建单链 突变体文库，针对亲本基因的各个目标突变区域分别设计引物，各引物方向相同，并通过向 PCR体系中添加DNA连接酶来连接各发生突变的核苷酸片段，得到完整的单链突变体；为构 建双链突变体文库，单链突变体的两端需带上额外的锚点序列，便于在双链化时，设计用于 特异性扩增单链突变体的引物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲本基因编码的是代谢途径基因。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲本基因的存在形式不受限制，可以 为质粒、基因组、双链DNA片段或者单链cDNA。
4. 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，为构建单链突变体文库，针对亲本 基因的一个或多个目标突变区域，分别设计相应的引物，称为编辑引物；所述编辑引物含有 需要向突变区域引入的突变碱基且3'和5'端分别有适当长度的与模板链匹配的序列；涉 及多个突变区域时，各编辑引物为同方向，均与同一模板链配对结合；另外设计两条与编辑 引物同方向的锚点引物，其中一条是上游锚点引物，一条是下游锚点引物，所述上游锚点引 物含有一段与模板链3'端匹配的核苷酸序列，此外，该上游锚点引物的5'端还有15-25bp 的锚点序列；所述下游锚点引物含有一段与模板链5'端匹配的核苷酸序列，此外，该下游 锚点引物的3'端还有15-25bp的锚点序列。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，需要进行突变的位点置于编辑引物的中 间部位，根据需要可进行高度简并。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述锚点引物，还兼具编辑引物的功能， 即在作为锚点引物的同时，还含有需要向突变区域引入的突变碱基。
7. 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述单链突变体文库与双链突变 体文库同时构建，是直接向构建单链突变体文库的PCR体系中添加特异结合单链突变体的 引物，边PCR获得单链突变体，边以单链突变体为模板进行双链化反应和双链突变体的扩 增反应；所述单链突变体文库和双链突变体文库分步构建时，直接以含单链突变体文库的 PCR混合物作为模板，不更换反应体系，直接向其中加入特异结合单链突变体的引物进行 第二轮PCR制备全长完整的双链突变体，或者以经柱纯化回收后的单链突变体文库作为模 板，重新配制反应体系进行第二轮PCR制备全长完整的双链突变体；为构建双链突变体文 库，以单链突变体作为模板，设计一对与锚点序列相匹配或相同的用于特异扩增单链突变 体的外端引物，只有发生突变的单链DNA能与外端引物结合。
8. 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述的单链突变体文库制备完成 后，在进行双链突变体文库的制备之前，采用DpnI限制性内切酶消化模板链。
9. 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，筛选突变体时，应用体外组装技术 将双突变体与载体连接。
10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的体外组装技术为融合PCR、Gibson 组装、T4 DNA聚合酶介导的重组技术或者体内酵母组装技术。
【专利摘要】本发明一种基于合成单链DNA文库进化代谢途径的方法，属于基因工程技术领域。本发明采用合成的DNA单链文库，以PCR技术介导重组突变文库的构建。突变文库重组表达载体后转化宿主进行高通量筛选进化突变株。本发明采用此技术，成功对代谢途径进行体外改造，获得了性质非常优异的突变株。本方法实现了基因的快速体外进化，操作简单，特别适合于对基因内部引入丰富的突变多样性，进行快速定向进化。
【IPC分类】C40B50-06
【公开号】CN104805508
【申请号】CN201510213073
【发明人】康振, 陈坚, 金鹏, 堵国成, 张俊丽
【申请人】江南大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月29日