[0054] 实验例4 利用 M184I 的 ARMS 引物探针 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 8 和 SEQ ID No. 10 作为引 物探针对，分别以实施例1制备的1%突变样本2、5%突变样本2、10%突变样本2、50%突 变样本2、100%突变样本2为模版进行PCR反应，以确定本发明中检测试剂盒对M184I的 检测灵敏度(在20yL体系中各组分的终浓度分别为IXRT-PCR缓冲液、0.8 mM dNTPs、2 mM MgC12、l. 6 U/μ L M-MLV 逆转录酶、0· 04 U/μ L Taq DNA 聚合酶、200ηΜ 引物、IOOnM Taqman探针、0.1~10 ng/μ L的阳性对照品）。PCR反应条件为：42°C逆转录30 min，一 个循环；95°C预变性3分钟，一个循环；40个扩增循环，95°C变形10秒，55~60°C退火并 延伸30秒。结果如图11所示。由图11可知，本发明公开的检测方法对M184I点突变的检 测灵敏度可以达到1%突变样本2。
[0055] 实验例5 利用 Q151M 的 ARMS 引物探针 SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 8 和 SEQ ID No. 10 作为引 物探针对，分别以实施例1制备的1%突变样本1、5%突变样本1、10%突变样本1、50%突 变样本1、100%突变样本1为模版进行PCR反应，以确定本发明中检测试剂盒对Q151M的 检测灵敏度(在20μ L体系中各组分的终浓度分别为IXRT-PCR缓冲液、0.8 mM dNTPs、2 mM MgC12、l. 6 U/μ L M-MLV 逆转录酶、0· 04 U/μ L Taq DNA 聚合酶、200ηΜ 引物、IOOnM Taqman探针、0.1~10 ng/μ L的阳性对照品）。PCR反应条件为：42°C逆转录30 min，一 个循环；95°C预变性3分钟，一个循环；40个扩增循环，95°C变形10秒，55~60°C退火并 延伸30秒。
[0056] 结果如图12所示。由图12可知，本发明公开的检测方法对Q151M点突变的检测 灵敏度可以达到1%突变样本1。
[0057] 实验例6 利用 K65R 的 ARMS 引物探针 SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7 和 SEQ ID No. 9 作为引 物探针对，分别以实施例1制备的1%突变样本2、5%突变样本2、10%突变样本2、50%突 变样本2、100%突变样本2为模版进行PCR反应，以确定本发明中检测试剂盒对K65R的 检测灵敏度(在20yL体系中各组分的终浓度分别为IXRT-PCR缓冲液、0.8 mM dNTPs、2 mM MgC12、l. 6 U/μ L M-MLV 逆转录酶、0· 04 U/μ L Taq DNA 聚合酶、200ηΜ 引物、IOOnM Taqman探针、0.1~10 ng/μ L的阳性对照品）。PCR反应条件为：42°C逆转录30 min，一 个循环；95°C预变性3分钟，一个循环；40个扩增循环，95°C变形10秒，55~60°C退火并 延伸30秒。结果如图13所示。
[0058] 由图13可知，本发明公开的检测方法对K65R点突变的检测灵敏度可以达到1%突 变样本2。
[0059] 实验例7 取50例已经产生耐药表型的HIV-I患者RNA样本作为模板，用本发明公开的试剂盒和 RT-ARMS-Taqman qPCR方法对M184V、M184I、Q151M和K65R四个点突变进行检测，检测所使 用的引物探针序列与实施例8所用的引物探针序列相同。同时将此检测方法与直接测序比 较。检测结果显示：本发明公开的试剂盒检测50份样本中，检测出8例样本有M184V突变 位点，3例样本有M184I突变位点，5例样本有Q151M突变位点，4例样本有K65R突变位点； 实际测序法检测50份样本中，检测出6例样本有M184V突变位点，3例样本有M184I突变 位点，4例样本有Q15IM突变位点，3例样本有K65R突变位点。
[0060] 从检测结果分析，本发明公开的试剂盒和RT-ARMS-Taqman qPCR方法检测M184V、 M184I、Q151M和K65R突变的灵敏度都超过直接测序法。
[0061] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发 明。
【主权项】
1. 用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的引物对和探针，其特征在于： 包括检测HIV-I病毒RNA的pol基因的第184位、151位和65位突变位点M184V、M184I、 Q151M和K65R的ARMS引物对和Taqman探针； M184V的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 8所示 的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo. 10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标记 5'端和3'端； M184I的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo. 2和SEQIDNo. 8所示 的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo. 10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标记 5'端和3'端； Q151M的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo. 5和SEQIDNo. 8所示 的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo. 10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标记 5'端和3'端； K65R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别SEQIDNo. 6和SEQIDNo. 7所示的 核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo. 9所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标记5'端 和3'端。2. 用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的引物对和探针，其特征在于： 包括检测HIV-I病毒RNA的pol基因的第184位突变位点M184V、M184I的ARMS引物对和 Taqman探针； M184V的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 8所示 的核苷酸序列； M184I的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo. 2和SEQIDNo. 8所示 的核苷酸序列； ARMS引物对的Taqman探针为SEQIDNo. 10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标 记5 '端和3 '端。3. 用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的引物对和探针，其特征在于： 包括检测HIV-I病毒RNA的pol基因的第151位突变位点Q151M的ARMS引物和Taqman探 针； Q151M的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo. 5和SEQIDNo. 8所示 的核苷酸序列， ARMS引物对的Taqman探针为SEQIDNo. 10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标 记5 '端和3 '端。4. 用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的引物对和探针，其特征在于： 包括检测HIV-I病毒RNA的pol基因的第65位突变位点K65R的ARMS引物和Taqman探 针； K65R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别SEQIDNo. 6和SEQIDNo. 7所示的 核苷酸序列， ARMS引物对的Taqman探针为SEQIDNo. 9所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标 记5 '端和3 '端。5. 用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的试剂盒，其特征在于：包括权 利要求1至4任一项所述的ARMS引物对和探针。6. 根据权利要求5所述的用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的试剂 盒，其特征在于：还包括RT-PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、M-MLV逆转录酶、TaqDNA聚合酶。7. 根据权利要求6所述的用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的试剂 盒，其特征在于：还包括模板RNA、试剂盒质控品引物对和试剂盒质控品的Taqman探针，试 剂盒质控品引物对的上游序列和下游序列分别为SEQIDNo. 11和SEQIDNo. 12所示的核 苷酸序列；试剂盒质控品的Taqman探针为SEQIDNo. 13所示的核苷酸序列，分别用FAM和 BHQl标记5'端和3'端。8. 根据权利要求7所述的用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的试剂 盒，其特征在于：各组分含量分别为： RT-PCR缓冲液终浓度0. 5X~2X; dNTPs终浓度 0? 6 ~I. 2mM; ARMS引物对的上、下游引物以及试剂盒质控品引物对的上、下游引物的终浓度均为 100 ~600nM; M-MLV逆转录酶终浓度0. 4~2. 4U/iiL; TaqDNA聚合酶终浓度0? 01~0? 06U/iiL; MgCl2终浓度为L5~3. 5mM; ARMS引物对的Taqman探针以及试剂盒质控品引物对的Taqman探针终浓度均为100~ 600nM； 模板RNA终浓度0? 01~lOOng/iiL。9. 根据权利要求6所述的用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的试剂 盒，其特征在于： RT-PCR缓冲液终浓度IX; dNTPs终浓度 0. 8mM; ARMS引物对的上、下游引物以及试剂盒质控品引物对的上、下游引物的终浓度均为 200nM； M-MLV逆转录酶终浓度I. 6U/iiL; TaqDNA聚合酶终浓度0? 04U/iiL; MgCl2终浓度为2mM; ARMS引物对的Taqman以及试剂盒质控品引物对的Taqman探针终浓度均为IOOnM; 模板RNA终浓度0? 1~IOng/uL。10. 权利要求1至4任一项所述的ARMS引物对和探针在检测艾滋病治疗药物3TC和 FTC耐药突变位点中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的引物对和探针，包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第184位、151位和65位突变位点M184V、M184I、Q151M和K65R 的ARMS引物和Taqman探针。本发明还提供了上述引物对和探针在检测3TC和FTC主要耐药突变位点M184V，M184I、Q151M和K65R中的应用。本发明试剂盒检测灵敏度高、特异性好、检测成本低，为临床艾滋病患者治疗提供了用药指导，实现了艾滋病患者个体化治疗，能够提高药物有效果性，延长艾滋病患者生存时间，具有广泛应用前景和社会效益。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104911252
【申请号】CN201510035285
【发明人】龚剑, 唐乃平, 谈小龙, 李娟
【申请人】江苏发士达生物科技有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年1月25日