统计采用t检验，卡方检验。
[0053] 2实验方法与结果
[0054] 2. 1甲型流感病毒鸡胚增毒试验
[0055] 取9日龄鸡胚，于照蛋机上标记气室，放置无菌净化台内，用75%乙醇和2%碘酊 分别消毒2次后，用无菌砂轮轻轻于气室隔膜处磨一小口，约0. 05cm直径大小（为针尖大 小）。
[0056] 取甲型流感病毒（粉状），分次加入0? 3mL生理盐水2~3次，混匀后，吸出置无 菌试管内，并稀释至2mL，吹打后，每个鸡胚接种0. 2mL甲型流感病毒，置37°C恒温箱内培养 48h〇
[0057] 以上9日龄鸡胚培养48h后，放入4 °C冰箱内，使血管内血液凝固，次日取出，置超 净台内，用75 %乙醇和2 %碘酊消毒后，用无菌镊子除去封口处石蜡，用镊子除去气室及隔 膜层，用无菌吸管轻轻吸取尿囊液（弃去混浊尿囊液）以上收集为增毒一次的尿囊液。以 上试验重复3次后，用于实验，实验前做血凝试验。
[0058] 2. 2血凝试验
[0059] 取24孔微孔板，每孔加入生理盐水0.5mL，（第1管加NS0.9mL)，将尿囊液编号 (以每只鸡胚），取尿囊液0.ImL加入第1管混匀后取出0. 5mL加入第二管内，依次稀释至 第8管，第9管不加病毒，做空白对照（生理盐水），随后取新鲜公鸡血（啼叫）用生理盐水 洗涤3次后配成0. 5 %鸡红细胞溶液（生理盐水）0. 25mL轻轻加入后摇匀，置室温放置2h 后观察记录。
[0060] 观察标准：
[0061] ++++: -层红细胞呈增殖状均匀铺于管底
[0062] +++:基本同上，但边缘较薄
[0063] ++:血球于管底形成一个环状，但四周有小凝集块
[0064] +:血球于管底形成小团，边缘不光滑整齐
[0065] 血球沉于管底形成小团，边缘光滑整齐
[0066] 实验结果判断：2、4、5、6、8收集尿囊液的血凝滴定均为640以上，可以用于体内感 染小鼠。
[0067] 2. 3甲型流感病毒感染小鼠致死量（LD5。）测定
[0068] 取ICR小鼠56只，体重13~16g，雌雄各半，随机分7组，每组8只，取增毒3次病 毒尿囊液，以10倍稀释，每组滴以各病毒浓度，观察14d内死亡数，按ReedMuench法计算。 结果：按ReedMuench法计算LD50=L71，甲型流感病毒LD5。= 10 L71。
[0069] 2. 4板蓝根提取物对甲型流感病毒感染小鼠的死亡保护作用
[0070] 取ICR小鼠220只，体重13~16g，雌雄各半，随机分为11组，每组20只。各组 动物均灌胃给药，给药量IOmL*kg\每日1次，连续7d。于给药当日，各组小鼠在乙醚浅度 麻醉下，以血凝滴度640以上的甲型流感病毒尿囊液给小鼠滴鼻感染，每只鼠50yL。观察 动物感染甲型流感病毒后发病及死亡情况，记录14d内死亡数，并进行组间比较，计算存活 率、存活天数。结果见表2。
[0071] 表2 2-吡咯烷酮-N-亚甲基--D-阿拉伯糖苷对甲型流感病毒A/PR8/34感染 小鼠死亡的保护
[0072]
[0073] ( "m"表示与模型对照组比较p〈0. 01 ;"AA"表示与正常对照组比较p〈0. 01)
[0074] 由表2的实验结果表明，本发明分离得到的2-吡咯烷酮-N-亚甲基I-D-阿拉 伯糖苷可明显延长甲型流感病毒感染小鼠后的存活天数，与模型对照组比较具有显著性 差异（p〈0. 01)，且能提高甲型流感病毒感染小鼠的存活率，与模型组比较具有显著性差异 (p〈0. 01)。且本实验表明2-吡咯烷酮-N-亚甲基-P-D-阿拉伯糖苷表现出比利马韦林更 好的抗病毒作用。
[0075] 实施例3化合物2-吡咯烷酮-N-亚甲基-P-D-阿拉伯糖苷的抗菌药效学研究
[0076] 1实验材料
[0077] I. 1受试药物
[0078] 实施例1分离得到的化合物2-吡咯烷酮-N-亚甲基-D-阿拉伯糖苷
[0079] L2实验试剂与仪器
[0080] 二甲基亚砜（分析纯）（国药集团化学试剂有限公司，T20080711);蛋白胨（0X0ID LP0042,OXOIDLID.BASINGSTOKE,HAMPSHIRE);牛肉膏（国药集团化学试剂有限公司， F20080107);氯化钠（分析纯）（广东?汕头市西陇化工厂，080719);琼脂粉（纯化）（国药 集团化学试剂有限公司，KS20080322)。
[0081]牛津杯（不锈钢管，内径6_，外径8_，高IOmm)，培养皿（直径90_，深20_， 大小一致，皿底平坦），带塞试管，锥形瓶，滴管，接种环，涂布器，移液枪，镊子，游标卡 尺。Spectrum752型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；手提式压力蒸汽灭 菌器（上海华线医用核子仪器有限公司）；PYX-DHS-40X50-S-II型隔水式电热恒温培养 箱（上海跃进医疗器械厂）；华利达HZ-9201K型台式恒温振荡器（太仓市科教器材厂）； SW-CJ-IFB型单人水平垂直两用净化工作台（苏州净化设备有限公司）；西铁城CT-513W电 子测温计（西铁城精电科技有限公司）。
[0082] 1.3实验用菌株
[0083] 金黄色葡萄球菌（ATCC25923)，大肠埃希菌（ATCC25922)，绿脓假单孢菌 (ATCC27853)，枯草芽孢杆菌（ACCC11060)，均购自江苏省疾控中心南京博达生物卫生技术 有限公司。
[0084] 1.4培养基的配制
[0085] 液体培养基：一般培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，琼脂粉（优质）12g， 蒸馏水1L。将上述成分（除琼脂外）溶于水中，校正pH7.2~7.4后，煮沸溶解，根据用 途不同进行分装，经121°C灭菌15min，倾注广口锥形瓶中，冷藏备用。固体培养基：一般培 养基：蛋白胨l〇g，牛肉膏5g，氯化钠5g，琼脂粉（优质）12g，蒸馏水1L。将上述成分（除 琼脂外）溶于水中，校正pH7.2~7.4后加入琼脂，煮沸溶解，根据用途不同进行分装，经 121°C灭菌15min，倾注平板或制成斜面，冷藏备用。
[0086] 1.5实验用药配制
[0087] 抑菌试验2-吡咯烷酮-N-亚甲基-P -D-阿拉伯糖苷：用生理盐水配成5mg ^mL 1 备用。
[0088] 2?实验方法与结果
[0089] 用琼脂平板扩散法进行抑菌圈DD值的测定。首先，将浓度为2 X IO8CFU?mL1的 菌液0. 1~0. 2mL均匀地涂在平板上，然后放置牛津杯，用移液枪将10yL样品注入牛津杯 中。将平板置于37°C培养箱中培养24h后，测量抑菌圈直径大小。每个菌种重复3次测定， 结果取平均值。DMSO为阴性对照。实验结果如表3所示：
[0090] 表3 2-吡咯烷酮-N-亚甲基-13 -D-阿拉伯糖苷的抑菌效果
[0091]
[0092] 以上结果显示：2_吡咯烷酮-N-亚甲基-D-阿拉伯糖苷组不同浓度时均有很 好的抑菌效果，高浓度时抑菌圈直径达到28_。
[0093] 实施例4片剂的制备
[0094] 取实施例1分离得到的2-吡咯烷酮-N-亚甲基-P -D-阿拉伯糖苷加药用辅料淀 粉、硬脂酸镁等适量，充分混匀后，压片，制成每片含Img上述化化合物的片剂口服使用。
[0095] 实施例5胶囊剂的制备
[0096] 取实施例1分离得到的2-吡咯烷酮-N-亚甲基-P -D-阿拉伯糖苷加药用辅料淀 粉适量，充分混匀后，装入胶囊，制成每粒含Img上述新化合物的胶囊剂口服使用。
[0097] 实施例6注射剂
[0098] 取2-吡咯烷酮-N-亚甲基-P -D-阿拉伯糖苷化合物，加注射用水，甘油适量，分 别制成每250ml含0. 5mg新化合物的注射液供静脉点滴使用。
[0099] 实施例7微囊的制备
[0100] 取阿拉伯胶粉适量，加入2-吡咯烷酮-N-亚甲基-0 -D-阿拉伯糖苷化合物、蒸馏 水适量制成初乳，并以3%阿拉伯胶液适量制成乳剂，将乳剂加热至45度时加入3%的明 胶液适量并用10%醋酸液调PH4. 1-4. 3,加入蒸馏水、3%甲醛适量，搅拌使其固化定形，用 5 %氢氧化钠调pH7. 0-7. 5,最后加入10 %淀粉适量，制成每克含Img2-吡咯烷酮-N-亚甲 基-0 -D-阿拉伯糖苷的微囊。
【主权项】
1. 一种具有抗病毒活性和抗菌活性的生物碱碳巧类化合物，其特征在于，它的化学结 构式如下：:〇2. 权利要求1所述的具有抗病毒活性和抗菌活性的生物碱碳巧类化合物在制备预防 和治疗病毒性疾病药物中的应用。3. 权利要求1所述的具有抗病毒活性和抗菌活性的生物碱碳巧类化合物在制备预防 和治疗细菌感染疾病药物中的应用。4. 一种具有抗病毒活性和抗菌活性的药物制剂，其特征在于，它由权利要求1所述的 生物碱碳巧类化合物与药学上可接受的药用辅料制成。5. 根据权利要求4所述的具有抗病毒活性和抗菌活性的药物制剂，其特征在于，所述 的药物制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、脂肪乳剂、微囊、软膏剂或透皮控释贴剂。
【专利摘要】本发明公开了一个从板蓝根中分离得到的一个具有抗病毒，抗菌活性的化合物2-吡咯烷酮-N-亚甲基-β-D-阿拉伯糖苷及其制备方法和药物用途。本发明对板蓝根活性成分进行深入研究，分离得到一个具有显著抗病毒和抗菌活性的化合物，该化合物为结构新颖的化合物。并且通过药理实验筛选结果表明，本发明分离得到的化合物具有很好的抗病毒和抗菌活性，且可以方便制备得到各种临床常用剂型，具有重要的应用价值。
【IPC分类】A61P31/04, C07H1/08, C07H7/00, A61P31/12, A61K31/7052
【公开号】CN105001275
【申请号】CN201510472437
【发明人】李祥, 陈建伟, 潘以琳, 陈勇
【申请人】南京中医药大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年8月5日