1，其中，所述SEQID NO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:8 和SEQIDNO:10 的 5' 端进行磷酸化处 理；每种探针的浓度为luM，可以分装也可以混合在一起；
[0074] (3)连接反应液，其包括：Ligase-65缓冲液A和Ligase-65缓冲液B，均购自 MRC-Holland公司；所述连接反应液的配方如表3所示；
[0075] (4)PCR反应液，其包括如序列表SEQIDNO: 11至SEQIDNO: 12所示的通用引 物Pl和P2,所述PCR反应液可以根据现有技术公知的方法自行配制也可以通过购买获 得，例如，购自TheMRC-Holland公司的PCR反应液，其包括dNTPs、Tris-HCl、KC1、EDTA、 BRIJ(0.04% )、通用引物Pl和P2 ;
[0076] (5)Ligase-65 连接酶，购自MRC-Holland公司；
[0077] (6)SALSA聚合酶 5U/yL，购自MRC-Holland公司；
[0078] (7)DEPC水；
[0079] (8)阴性对照；
[0080] (9)阳性对照：蓝舌病病毒NS3基因、牛病毒性腹泻病毒5'UTR基因、牛地方流
[0081] 行性白血病病毒gP51基因、牛传染性鼻气管炎病毒gB基因、口蹄疫病毒3D基
[0082] 因的阳性重组质粒DNA的混合物。。
[0083] 2、试剂盒的使用方法
[0084] 2. 1DNA/RNA提取
[0085]2. 2RNA反转录成cDNA
[0086] 用Promega公司的M-MLV反转录试剂盒，利用随机引物，将样品RNA反转录后获 得cDNA;反转录反应体系（20yL) :5XRT-缓冲4yL，dNTP(2. 5mM) 4yL，M-MLV反转录酶 ((200U/yL)IyL，反转录酶抑制剂（40U/yL) 0. 5yL)，随机引物（0. 5yg/yL)IyL，样品 RNA9. 5yL。反应条件：25。(：/IOmin42。(： /60min95。(： /5min(TC/5min。
[0087] 2. 3MLPA检测
[0088] 2. 3.IDNA变性
[0089]取n个0. 2mLPCR反应管（n=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），做好标记； 每管加入5yL制备好的DNA溶液，98°C变性5min，然后冷却到25°C。
[0090] 2. 3. 2杂交反应
[0091] 每个杂交反应需要I. 5yLMLPABuffer和I. 5yL探针混合物，根据需要配制好 杂交反应液，充分混匀后，吸取3yL加入2. 2的PCR反应管中。
[0092] 反应条件：95°C温育lmin，60°C杂交 16-20h，54°C温育。
[0093] 2. 3. 3连接反应
[0094] 每个连接反应需要31yL连接反应液和IyLLigase-65连接酶，根据需要配制好 杂交反应液，充分混匀后，吸取32yL加入2. 2的PCR反应管中。
[0095] 反应条件：54°C连接 15min，98°C灭活 5min，20°C停留。
[0096] 2. 3. 4PCR反应
[0097] 每个PCR反应需要9. 5yLPCR反应液和0.5ulSALSA聚合酶，根据需要配制好 PCR反应液，充分混匀后，吸取10yL加入2. 2的PCR反应管中。
[0098] 反应条件：951€3〇86(：，6〇1€3〇86(：，721€6〇86(：，35个循环 ；72。(：孵育2〇111111，151€ 停留。
[0099] 2. 3. 5毛细管电泳仪凝胶电泳：
[0100] 将PCR扩增产物置于毛细管电泳仪加样板上电泳，并以15-500bp标定Marker和 25bpDNAMarker作为对照，观察电泳结果并记录。
[0101] 2. 4结果描述及判定
[0102] ①质控标准：
[0103] 阳性对照在146bp、120bp、110bp、98bp、88bp处有特异性扩增条带。
[0104] 阴性对照无特异性扩增条带。
[0105] 如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次试验视为无效。
[0106] ②结果判断：
[0107] 阳性：在146bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在口蹄疫病毒；在120bp处有 特异性扩增条带，表示样本中存在牛地方流行性白血病病毒。在IlObp处有特异性扩增条 带，表示样本中存在牛病毒性腹泻病毒；在98bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在牛 传染性鼻气管炎病毒；在88bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在蓝舌病病毒。必要时 对MLPA扩增产物测序，进行确认试验。
[0108] 阴性：无特异性扩增条带，表明样品中无口蹄疫病毒、牛地方流行性白血病病毒、 牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒。
[0109] 实施例2、试剂盒的灵敏度试验
[0110] 1、材料
[0111] 蓝舌病灭活病毒、牛病毒性腹泻灭活病毒、牛传染性鼻气管炎灭活病毒均由实验 室保存，牛地方流行性白血病灭活病毒由中国兽药监察所提供，0型口蹄疫灭活病毒由中国 农业科学院兰州兽医研究所提供。
[0112] 2、方法
[0113] 1)体外重组质粒DNA的制备
[0114] 蓝舌病病毒NS3基因阳性重组质粒的制备：克隆蓝舌病病毒NS3基因，回收PCR扩 增产物，长度为492bp，与pGEM-T载体（购自PromeGA公司）进行连接，转化JM109感受态 细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得蓝舌病病毒NS3的阳性重组质粒，命 名为BTV-NS3-DNA;蓝舌病病毒NS3基因序列如序列表中SEQIDNO:13所示。
[0115] 牛传染性鼻气管炎病毒gB基因阳性重组质粒的制备：克隆牛传染性鼻气管炎病 毒gB基因，回收PCR扩增产物，长度为365bp，与pGEM-T载体（购自PromeGA公司）进行连 接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得牛传染性鼻气 管炎病毒gB基因的阳性重组质粒，命名为IBRV-gB-DNA;牛传染性鼻气管炎病毒gB基因基 因序列如序列表中SEQIDNO:14所示。
[0116] 牛病毒性腹泻病毒5'UTR基因的阳性重组质粒的制备：克隆牛病毒性腹泻病毒 5'UTR基因，回收PCR扩增产物，长度为284bp，与pGEM-T载体（购自PromeGA公司）进行 连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得牛病毒性 腹泻病毒5'UTR基因的阳性重组质粒，命名为BVDV-5'UTR-DNA;牛病毒性腹泻病毒5'UTR 基因序列如序列表中SEQIDNO:15所不。
[0117] 牛地方流行性白血病病毒gP51基因的阳性重组质粒的制备：克隆牛地方流行性 白血病病毒gP51基因，回收PCR扩增产物，长度为500bp，与pGEM-T载体（购自PromeGA公 司）进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得牛 地方流行性白血病病毒gP51基因的阳性重组质粒，命名为EBLV-gP51-DNA;牛地方流行性 白血病病毒gP51基因序列如序列表中SEQIDNO:16所示。
[0118] 口蹄疫病毒3D基因体外转录RNA制备：扩增0型口蹄疫病毒3D基因的RT-PCR 扩增产物，长度为1410bp，与pGEM-T载体（购自Promega公司）进行连接，转化JM109 感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为 pGEM-FMDV-S。以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的RiboMAXTM LargeScaleRNAProductionSystem_T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNAse 除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到口蹄疫病毒3D基因的体外转 录RNA，命名为FMDV-3D-RNA; 口蹄疫病毒3D基因序列如序列表中SEQIDNO:17所示。
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