9] 2)DNA/RNA溶液拷贝数测定
[0120] 取制备好的体外重组质粒DNA用无RNA酶的灭菌水分别作200倍稀释，用紫外 分光仪测定其260nm和280nm的吸光度值（0D260和0D280)，计算待测样品的浓度与纯 度。纯DNA:0D260/0D280~1.8( > 1.9,表明有RNA污染；< 1.6,表明有蛋白质、酚等 污染），纯RNA:1. 7 < 0D260/0D280 < 2. 0 ( < 1. 7时表明有蛋白质或酚污染；> 2. 0时 表明可能有异硫氰酸残存）。DNA样品的浓度（yg/yL) :0D260X稀释倍数X50/1000， RNA样品的浓度（yg/yL) :0D260X稀释倍数X40/1000。同时根据测序结果，利用 DNAMN(Version6)推算出RNA和DNA的分子量（Mff)，并按以下公式计算拷贝数（Copies/ ^1) = (6.02\ 1023〇〇卩168/111〇1)\(浓度]1区/]11)/(丽区/1]1〇1)〇
[0121] 3)多重连接探针扩增方法检测极限的确定
[0122] 取上述已知浓度的DNA/RNA溶液各10yL，充分混匀后，制成阳性标准品。将该标 准品10倍梯度稀释后，按最佳条件进行MLPA检测，并用去离子水作为阴性标准。通过对不 同稀释度标准品的检测，确定MLPA方法的检测极限。
[0123] 3、结果
[0124] I) DNA/RNA溶液拷贝数测定结果
[0125] 将制备好的质粒DNA/RNA分别用紫外分光仪测定其260nm和280nm的吸光度值并 推算出拷贝数，详细见表4。
[0126] 表4 :RNA和DNA纯度及含量测定
[0127]
[0128] 2)多重连接探针扩增方法检测极限的确定
[0129] 利用建立的多重连接探针检测方法，对10倍系列稀释的阳性标准品进行检测，结 果该方法最低可检测到约3. 7XIO3拷贝蓝舌病病毒、2. 71X10 3拷贝牛传染性鼻气管炎病 毒、12.IXIO3拷贝牛病毒性腹泻病毒、8.21X103拷贝牛地方流行性白血病病毒、6.72X103 拷贝口蹄疫病毒。由此可见该检测方法的灵敏度可达2000~8000拷贝/反应。
[0130] 实施例3、试剂盒的特异性试验
[0131] 1、材料
[0132] 表5特异性试验研究过程中应用到的病毒和核酸
[0135] 2、方法
[0136] 用蓝舌病病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛地方流行性白血病病毒、牛传染性鼻气管炎 病毒和口蹄疫病毒五种病毒中的任何一组探针分别对其它4种病毒核酸进行MLPA检测，以 验证方法的特异性。
[0137] 3、结果
[0138] 用五种病毒中的任意一组探针进行MLPA检测，只能从其对应的病毒模板中扩增 出预期大小的目的片段，对其余四种病毒均无扩增信号，表明所建立的方法特异性良好，结 果如图1~6所示。
[0139] 实施例4 :试剂盒对临床样品检测的实验报告
[0140] 1、材料
[0141] 我国直属出入境检验检疫局提供的已知样品165份。
[0142] 2、方法
[0143] 对我国直属出入境检验检疫局提供的已知样品165份进行检测。在实际样品中验 证方法的敏感性和特异性。
[0144] 3、结果
[0145] 对165份已知样品进行检测，结果显示建立的方法可检出其中所有的蓝舌病病 毒、牛病毒性腹泻病毒、牛地方流行性白血病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和口蹄疫病毒阳 性样品，而且未出现假阳性结果，结果见表6,表明建立的方法可靠实用。
[0146] 表6临床样品的检测结果
[0148] 显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对 本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发 明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【主权项】
1. 用于同时检测蓝舌病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛地方流行 性白血病病毒和口蹄疫病毒的引物和多重连接探针，其特征在于，所述多重连接探针如序 列表SEQ ID NO :1至SEQ ID NO: 10所示，所述引物如序列表SEQ ID NO :11至SEQ ID NO: 12所示。2. 根据权利要求1所述的引物和多重连接探针，其特征在于，所述序列SEQ ID NO :1和 SEQ ID NO :2分别为检测蓝舌病病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4分别为检测牛传染性鼻气管炎病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6分别为检测牛病毒性腹泻病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8分别为检测牛地方流行性白血病病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO :9 和SEQ ID NO :10分别为检测口蹄疫病毒的短探针和长探针，其中，所述SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :8 和 SEQ ID NO : 10 的 5' 端进行磷酸化处理。3. -种检测蓝舌病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛地方流行性白 血病病毒和口蹄疫病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒，其包括： (1) MLPA缓冲液； (2) 探针，其包括如序列表SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO :10所示的用于检测蓝舌病病 毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛地方流行性白血病病毒和口蹄疫病毒的 多重连接探针，其中，所述 SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :8 和 SEQ ID NO : 10的5'端进行磷酸化处理； (3) 连接反应液，其包括：Ligase-65缓冲液A和Ligase-65缓冲液B ; (4) Ligase_65 连接酶； (5) PCR反应液，其包括如序列表SEQ ID NO: 11至SEQ ID NO :12所示的引物； (6) SALSA聚合酶； (7) DEPC 水； (8) 阴性对照； (9) 阳性对照。4. 根据权利要求3所述的多重连接探针扩增检测试剂盒，其特征在于，所述序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2分别为检测蓝舌病病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO : 3和SEQ ID NO :4分别为检测牛传染性鼻气管炎病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6分别为检测牛病毒性腹泻病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8分别为检测牛地方流行性白血病病毒的短探针和长探针；所述序列 SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10分别为检测口蹄疫病毒的短探针和长探针。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测蓝舌病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛地方流行性白血病病毒和口蹄疫病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒及引物和探针。所述多重连接探针如序列表SEQ？ID？NO：1至SEQ？ID？NO：10所示，所述引物如序列表SEQ？ID？NO：11至SEQ？ID？NO：12所示。使用本发明所述的引物、探针，和/或包含该引物和探针的多重连接探针扩增检测试剂盒可同时检测蓝舌病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛地方流行性白血病病毒和口蹄疫病毒5种重要牛病病原，节约了检测时间和成本，有利于疫病的及时确诊。
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN105002301
【申请号】CN201510463254
【发明人】史喜菊, 马贵平, 柏亚铎, 郝俊虎, 乔彩霞, 刘全国, 李炎鑫, 李冰玲
【申请人】中华人民共和国北京出入境检验检疫局
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月31日