用于检测经典型和变异型猪伪狂犬病毒的实时荧光pcr-hrm引物的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一组用于检测经典型和变异型猪伪狂犬病毒的实时荧光PCR-HRM引物，属于动物传染病学领域。
【背景技术】
[0002]伪狂犬病(Pseudorabies virus，PR)是由伪狂犬病毒(PRV)引起的猪和多种家畜及野生动物共患的一种流行广泛，以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为特征的急性传染病。猪是感染后可以存活的唯一物种。感染后临床症状因日龄不同而表现不一，仔猪出现脑脊髓炎和败血症，两周内发病率可达100% ;妊娠母猪发生流产、产死胎等繁殖障碍；生长育肥猪发生严重的呼吸道症状。近年来伪狂犬基因缺失苗成功开发及广泛使用，结合血清学的鉴别检测，该病总体得到控制。
[0003]但2011年以来，许多使用基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场出现了 PRV流行，主要表现为猪群gE抗体阳性率显著升高，发病母猪群流产、仔猪神经症状和死亡率高等典型伪狂犬病症状。随后，该病征在我国多地规模化猪场相继爆发和流行。利用微量中和实验进行血清学分析表明，这种新发PRV和经典的Bartha k61疫苗产生的抗体在抗原性方面存在一定的差异，简称变异型PRV。
[0004]目前，在生产实践中广泛使用的是gE基因缺失基因工程疫苗，通过对分离鉴定的变异型和经典型PRV毒株的gE基因全长进行序列测定后发现，变异型PRV和经典型PRV在1488-1490位CGA (即492位存在有天冬氨酸)插入。
[0005]高分辨率熔解曲线(High Resolut1n Melt, HRM )是一种简单、快速、低成本的PCR扩增后检测技术，可用于高通量的突变扫描和基因分型。该技术仅仅只是在标准PCR试剂的基础上再加入双链DNA结合染料即可进行，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线，即可完成对样品基因型的分析。当使用SYBR Green I为荧光染料时，在实时荧光PCR扩增结束后通常要运行一步熔解曲线反应程序。即将PCR产物的温度由低到高逐步升高，在升温的过程中，双链DNA解链成单链DNA分子，原先与双链结合的荧光染料分子就与DNA脱离，而不再产生荧光信号。因此，随着温度的升高，样品的荧光信号由强转弱，从而形成一个荧光信号随温度升高而减弱的熔解曲线图，再以荧光值随温度的变化率为纵坐标作图，就形成荧光变化率随温度变化的峰形图，每一个样品在该图上呈现为一个峰形曲线。这个峰值所对应的特定温度我们就称之为该样品的熔解温度Tm，在该温度下50%的双链已解链变为单链。
[0006]本发明根据变异型PRV和经典型PRV在1488-1490位CGA插入而导致实时荧光PCR扩增后形成的Tm值差异，来对变异型PRV和经典型PRV感染情况进行鉴别诊断。本发明对两种不同类型PRV进行一组引物即可特异性鉴别诊断，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一组用于检测经典型和变异型PRV的PCR-HRM引物，该引物能有效区分经典型和变异型PRV。
[0008]本发明根据经典型和变异型PRV的gE基因特征，设计一组引物，该引物可同时对经典型和变异型PRV的gE基因片段进行特异性扩增，均可获得特异性目的片段，但用常规PCR无法对经典型和变异型PRV进行鉴别诊断。但是由于经典型和变异型PRV的gE基因片段V在1488-1490位CGA插入而导致GC含量差异，通过建立基于SYBR I实时荧光定量PCR对经典型和变异型PRV后的Tm值存在不同，根据熔解曲线峰值的差异可直接对经典型和变异型PRV进行区别。
[0009]本发明采用以下技术方案:
一组用于经典型和变异型PRV的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所示:
上游引物 Pl:5’ - CACGCACGAGGACTACTACGA -3’
下游引物 P2:5’ - TCCTCGGGGTCCAGGCTCGCGTA -3’。
[0010]本发明PCR-HRM方法，具体包含以下步骤:
(I )、从疑似临床样品中提取基因组DNA ；
(2)、以提取的DNA为模板，用权力要求I所述的引物Pl和P2进行实时荧光定量PCR扩增；
(3)、利用高分辨率熔解曲线(HRM)方法导致的经典型和变异型PRV熔解温度(Tm)值差异，对经典型和变异型PRV进行鉴别诊断。
[0011]所述的PCR-HRM引物在制备鉴别诊断经典型和变异型猪伪狂犬病毒试剂盒上的应用。
[0012]其中，本发明的引物设计需满足如下要求:
(I)该实时荧光定量PCR产物需选择经典型和变异型PRV的gE基因中的保守区域进行设计，以便该组引物(Pl和P2)通过实时荧光定量PCR均能对经典型和变异型PRV进行扩增，通过生成的熔解曲线获得不同的特异性峰值，通过和实时荧光定量PCR—起相连接的电脑主机程序中的Tm值差异，来对经典型和变异型PRV感染情况进行判定。
[0013]其中，所述的步骤的峰值如下:
若在Tm=93.6 °C出现单一的特异性峰判为变异型PRV阳性；若在Tm=92.9 °C出现单一的特异性峰判为经典型PRV阳性。
[0014]本发明的有益效果:本发明所提供的引物特异性强，灵敏度高，鉴定方法简单，效率和准确率较高。使用本研究提供的一组实时荧光定量PCR引物对本临床送检9份疑似猪伪狂犬病毒感染情况进行可视化鉴别诊断的方法，其中新型猪伪狂犬病毒7株，经典型猪伪狂犬病毒2株。
【附图说明】
[0015]图1特异性实时荧光定量PCR引物对经典型和变异型PRV进行检测的熔解曲线。I为经典型PRV阳性，2为变异型PRV阳性，3为经典型和变异型PRV阴性。
[0016]图2经典型和变异型PRV的gE基因差异区。
【具体实施方式】
[0017]下面实施例对本发明做进一步的描述。
[0018]实施例1
毒株:
经典型和变异型PRV均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定和保存。
[0019]2、引物设计与合成
根据经典型和变异型PRV的gE基因特征设计实时荧光定量PCR引物Pl和P2，其中引物Pl和P2序列为:
上游引物 Pl:5’ - CACGCACGAGGACTACTACGA -3’
下游引物 P2:5’ - TCCTCGGGGTCCAGGCTCGCGTA -3’。
[0020]该引物扩过经典型和变异型PRV的gE基因差异区，经典型和变异型PRV的gE基因差异区见图2。
[0021 ] 实时荧光定量PCR扩增
以常规方法提取经典型和变异型PRV的基因组DNA。用所设计的特异性实时荧光定量PCR引物Pl和P2进行实时荧光定量PCR扩增。
[0022]优化出的20 μ L最佳反应体系为体系:SYBR Premix Ex TaqTM 10 yL、上、下游引物(5 ymol/L)各0.4 yL、模板2 μ L、水补足至20 yL。最佳反应条件为:95 °C，2min预变性；95 V 10 s，62 V 15 s，共40个循环，循环结束后，做出熔解曲线。
[0023]4、实时荧光定量PCR熔解曲线
实时荧光定量PCR反应结束后，根据做出的熔解曲线，根据经典型和变异型PRV在gE基因出存在不同特征，对经典型和变异型PRV感染情况进行判断，判断方法为:
从生成的熔解曲线可见看出，若在Tm= (93.6 ±0.1) °C出现单一的特异性峰判为变异型PRV阳性；若在Tm= (92.9±0.1) °C出现单一的特异性峰判为经典型PRV阳性。
[0024]临床应用
应用本方法对临床送检9份疑似猪伪狂犬病毒感染情况进行可视化鉴别诊断的方法，其中新型猪伪狂犬病毒7株，经典型猪伪狂犬病毒2株。本发明的这组引物还可用来对猪群感染经典型和变异型PRV的类型和程度进行定量分析。
[0025]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.用于检测经典型和变异型猪伪狂犬病毒的实时荧光PCR-HRM引物，其特征在于:所述引物组其核苷酸序列如下所示: 上游引物 Pl:5’ - CACGCACGAGGACTACTACGA -3’ 下游引物 P2:5’ - TCCTCGGGGTCCAGGCTCGCGTA -3’。2.如权利要求所述的引物用于检测经典型和变异型猪伪狂犬病毒的实时荧光PCR-HRM方法，其特征在于，包含以下步骤: (I )、从疑似临床样品中提取基因组DNA ； (2)、以提取的DNA为模板，用权力要求I所述的引物Pl和P2进行实时荧光定量PCR扩增； (3)、利用高分辨率熔解曲线方法导致的经典型和变异型猪伪狂犬病毒熔解温度(Tm)值差异，对经典型和变异型PRV进行鉴别诊断。3.如权利要求1所述的PCR-HRM引物在制备鉴别诊断经典型和变异型猪伪狂犬病毒试剂盒上的应用。
【专利摘要】本发明涉及一组用于检测经典型猪伪狂犬病毒（Pseudorabies？virus,PRV）和变异型猪伪狂犬病毒的引物，属于动物传染学领域。该引物根据经典型PRV和变异型PRV在gE基因上的差异设计，由于变异型PRV和经典型PRV在492位氨基酸处各插入一个天冬氨酸，经过实时荧光定量PCR扩增后，会导致出现不同的熔解温度（Tm）峰值差异，即建立区分变异型PRV和经典型PRV感染情况的高分辨率熔解曲线（HRM）方法。本发明设计的引物仅需一组引物即可对变异型PRV和经典型PRV进行鉴别诊断，同时还可特异性的明确猪只感染经典型和变异型PRV的感染程度。本发明使用方法简单有效，成本低廉，准确性高。
【IPC分类】C12Q1/70, C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105018645
【申请号】CN201510451308
【发明人】陈如敬, 吴学敏, 周伦江, 陈秋勇, 车勇良, 严山, 王晨燕, 王隆柏, 魏宏, 刘玉涛
【申请人】福建省农业科学院畜牧兽医研究所
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月29日