去，酶标仪检测A590。
[0062] 3)ELISA检测
[0063] A.使用乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（酶联免疫法）为上海科华生物股份有 限公司生产，产品编号为YBS00192010 ;
[0064] B.操作按使用说明；
[0065] C.配置工作浓度洗涤液（以纯化水做25倍稀释，待用）；
[0066] D?加入75ul待测样本（也即稀释1倍的细胞上清液）；
[0067] E.用封片纸覆盖反应板后，将反应板置37°C孵育60分钟；
[0068] F.取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本的孔中加入50ul酶结合物；
[0069] G.手工轻轻震荡10秒；
[0070] H.用封片纸覆盖反应板后，置于37°C孵育30分钟；
[0071]I.取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次；
[0072] J.洗涤结束后立刻在所有孔内加入A，B显色液各50ul ;
[0073] K.手工轻轻震荡10秒；
[0074] L.封片纸覆盖后，37°C孵育30分钟；
[0075] M.在所有孔内加入50ul终止液，震荡反应板5秒，使之充分混匀；
[0076] N.用酶标仪读书，波长450nm〇
[0077] 如图5所示，初筛实验中共得到77个RNAi pool，这77个RNAi pool的z-score 值均大于1. 96,共针对73个基因。基因沉默后的单位细胞HBV分泌相对值与阴性对照组单 位细胞HBV分泌相对值的比值，即Ratio to Ctr。
[0078] 3、初筛验证一针对初筛所有阳性基因，ELISA检测进行二次重复在96孔板中筛选 时，每个基因用上述病毒进行感染，且采用3孔平行。感染后120小时，对上清液进行ELISA 检测（代表上清中HBV的滴度），同时对细胞活性进行MTS检测（代表或细胞数量）
[0079] 根据生物学意义Ratio to Ctr，将z-score绝对值大于1. 96,同时满足Ratio to Ctr值大于 1.5或小于0.7定义为阳性RNAi pool，即primary high-throughput screening hit，共 51 个 RNAi pool, 48 个基因。
[0080] 如初筛条件一样，对筛选实验中的51个阳性RNAi pool进行了重复，即初筛验证。 根据Ratio to Ctr计算，得到了 38个RNAi pool (74. 5%)得到重复，共35个基因。数据 分析时将Ratio to control分级，抑制率为0? 2-0. 7为一级，0? 7-1. 5为二级，大于1. 5 为三级。两次重复的抑制率若在同一个等级，则认为两次重复结果一致。基因列表1如下。
[0081] 表1筛选的阳性基因
[0082]
[0084] 4、数据统计分析
[0085] 根据每个基因RNAi和对照NC的"单位细胞HBV分泌相对值"的比较来确定基因 在knockdown后IfepG22. 2. 15分泌HBV的能力变化；单位细胞HBV分泌相对值=ELISA检 测值/MTS检测值；
[0086] 数据统计：将每个样本的单位细胞HBV分泌相对值换算为log2 (sample value)， 根据 Z score 值计算出每个样本的 Z score 值 Robust Z-score = x-median(sample)/ MAD (sample) *1. 4826, X为每个样本单位细胞HBV分泌相对值的log2,然后选取Z-sore绝 对值大于1. 96的最为阳性基因进行验证。
[0087] 5、阳性片段验证一针对阳性基因，每个基因分别独立包装8个shRNA慢病毒， ELISA检测筛选有效片段
[0088] 针对初筛验证中的阳性RNAi pool，选取基因沉默后抑制单位细胞HBV分泌相对 值大于30 %的RNAi pool，分别独立包装4个shRNA片段慢病毒感染IfepG2. 2. 15细胞，同 时在三块96孔板中设置同样的重复。感染120个小时后，ELISA检测上清中HBV病毒分 泌量，同时MTS检测细胞活性，得以计算出单位细胞HBV分泌相对值，从而筛选出阳性基因 P4HB的有效shRNA片段。结果如图6和7所示。
[0089] P4HB 基因包含有序列为 CGACAGGACGGTCAITGATTA(SEQ ID No:17)的目的基因片 段，其引物序列是：
[0090] F ：
[0091] GATCCGGCGACAGGACGGTCATTGATTAGGTACCTAATCAATGACCGTCCTGTCGTTTTTG(SEQ ID No:11)；
[0092] R：
[0093] AATTCAAAAACGACAGGACGGTCATTGATTAGGTACCTAATCAATGACCGTCCTGTCGCCG(SEQ ID No:12)〇
[0094] 本发明筛选出P4HB基因的有效shRNA片段后，使用有效shRNA片段感染 IfepG2. 2. 15细胞96小时后，收取细胞RNA样品，qPCR检测目的基因的knockdown效果。结 果显示P4HB的有效shRNA片段可以有效地抑制目的基因表达，沉默效果达60%以上。
[0095] 本发明以IfepG2. 2. 15为HBV研究模式细胞，以ELISA和MTT为检测手段，使用人 激酶和自噬相关基因RNAi慢病毒文库共1092个基因，经过初筛，初筛重复验证后，共筛选 出35个（3. 2% )宿主基因参与HBV感染的调控。进一步利用生物信息学分别对35个阳性 基因进行分析，并经过shRNA短片独立包装病毒感染和qPCR验证，P4HB基因均筛选出有效 的shRNA片段，发现其中P4HB基因与HBV基因组蛋白有密切联系。这个基因与HBV的相关 性均未曾被报道过。
[0096] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实 例对本发明进行了详细的说明，对本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所 记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并 不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
【主权项】
1. 一种抑制P4HB基因表达的抑制剂，其特征在于它包括带有有效抑制P4HB基因表达 的shRNA序列的载体，所述shRNA序列为： F：GATCCGGCGACAGGACGGTCATTGATTAGGTACCTAATCAATGACCGTCCTGTCGTTTTTG ； R ：AATTCAAAAACGACAGGACGGTCATTGATTAGGTACCTAATCAATGACCGTCCTGTCGCCG〇2. 根据权利要求1所述的抑制P4HB基因表达的抑制剂，其特征在于：所述P4HB基 因包含有序列为CGACAGGACGGTCATTGATTA的目的基因片段。3. 根据权利要求1所述的抑制P4HB基因表达的抑制剂，其特征在于：所述载体为 pUCTPo4. 根据权利要求1或2或3所述的抑制P4HB基因表达的抑制剂在制备用于治疗乙肝 的药物中的应用。5. 根据权利要求4所述的抑制P4HB基因表达的抑制剂在制备用于治疗乙肝的药物中 的应用，其特征在于：将所述shRNA与载体连接后形成慢病毒表达质粒，所述慢病毒表达质 粒经扩增后与包装辅助质粒共转染293T细胞，转染后培养并收集上清病毒粗液，通过超离 心浓缩，得到高滴度的慢病毒浓缩液，将所述慢病毒浓缩液感染带有HBV的宿主细胞。6. 根据权利要求5所述的抑制P4HB基因表达的抑制剂在制备用于治疗乙肝的药物中 的应用，其特征在于：所述扩增为：将所述慢病毒表达质粒转入GeneHogs化学感受态细菌， 经PCR扩增选取阳性克隆后提取的质粒即为扩增后的慢病毒表达质粒。7. 根据权利要求5所述的抑制P4HB基因表达的抑制剂在制备用于治疗乙肝的药物中 的应用，其特征在于：转染后培养48-72h收集上清病毒粗液。8. 根据权利要求5所述的抑制P4HB基因表达的抑制剂在制备用于治疗乙肝的药物中 的应用，其特征在于：所述宿主细胞为IfepG2. 2. 15细胞。
【专利摘要】本发明提供了一种抑制P4HB基因表达的抑制剂及其在制备用于治疗乙肝的药物中的应用。本发明在HBV稳定表达的HepG2.2.15细胞中，大规模功能性地沉默人基因组中所有激酶基因和自噬基因，经过实验筛选出的P4HB基因为可以抑制HBV分泌的阳性基因，并且进一步确定出阳性基因P4HB的有效shRNA片段，本发明系统性阐明激酶以及宿主细胞自噬对HBV复制的影响，揭示了激酶信号和自噬调控网络在HBV－宿主－肝癌三者之间的关系，为新一代抗HBV治疗提供新药物靶点和理论依据。
【IPC分类】C12N15/113, A61K31/713, C12N15/867, A61K48/00, A61P31/20, A61P1/16
【公开号】CN105039409
【申请号】CN201510505436
【发明人】宣世英, 辛永宁, 芦琳琳, 李伟娜
【申请人】青岛市市立医院
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月17日