XGY〇
[0028]BMMY(IL):溶解lOg酵母提取物、20g蛋白胨于 700mLddH20 中，121°C灭菌 20min， 冷至室温，加入 100mLlmol/L磷酸钾缓冲液（pH6.0)，100mL10XYNB，2mL500XB，100mL 10XM〇
[0029] 25%聚乙烯醇橄榄油乳化液（1L):称取3g聚乙烯醇，加蒸馏水150mL，加热搅拌溶 解成2%溶液。向其中加入50mL橄榄油，用高速组织捣碎机搅动3~4次，每次10s。
[0030] 橄榄油-MMH-RB平板（1L):橄榄油乳化液800mL，加入15g琼脂，121 °C灭菌 20min，冷至 6(TC时，加入 100mL10XYNB，2mL500XB，100mL10XM，100mL10XRB，10mL 100XH，混勾后倒平板。
[0031] -定浓度三辛酸甘油酯聚乙烯醇乳化液：称取3g聚乙烯醇，加蒸馏水150mL，加热 搅拌溶解成2%溶液。以2%聚乙烯醇溶液：三辛酸甘油酯体积比为3:1配置，使用微型高 速匀浆机搅拌4-5次，每次20s，直至出现白色乳化液，若不均匀或分层，可稍微加热或增加 搅拌次数和时间。
[0032] 三辛酸甘油酯平板（1L):以10g酵母提取物、20g蛋白胨于900mLddH20中溶解，加 入一定浓度的三辛酸甘油酯聚乙烯醇乳化液，用去离子水定容至1L(需要加10XD则无需 定容），混匀，加入1.5% (w/v)的琼脂粉，121°C灭菌20min，根据需要，灭菌后加入10XD， 倒平板，可4°C保存。
[0033] 实施例1
[0034] 酿酒酵母S. cerevisiae EBY100基因组的提取，步骤如下：
[0035] (1)S.cerevisiaeEBY100购自Invitrogen。首先在YPD平板上活化菌株，挑取单 菌落于Yro摇瓶中，30 °c过夜培养。
[0036] (2)取对数生长期的菌体5000rpm/min离心5min，菌体用无菌蒸馏水洗一次，去上 清。
[0037] (3)加入 5mLDNA破壁缓冲液（100mmol/LTris-HCl,pH8. 0,lOmmol/LEDTA, 1 % SDS)，混匀，65°C保温lh。
[0038] (4)lOOOOrpm离心 15min，取上清。
[0039] (5)加酸氯仿异戊醇（25:24:1)抽提2次，每次5000rpm离心7min。
[0040](6)取上层抽提液，加6 y L RNaseA (10mg/mL)，用3倍乙醇沉淀过夜（加0? 3mol/ L醋酸钠，pH5. 2)。12000rpm离心30min。
[0041] (7) 75%乙醇洗2次，风干。
[0042] (8)加50 y L无菌超纯水溶解。
[0043] 实施例2
[0044] 米根霉脂肪酶（R0L)毕赤酵母细胞表面展示系统的构建，步骤如下：
[0045]A?表面展示重组质粒载体pPICZa A-R0L构建
[0046] 克隆米根霉脂肪酶基因R0L，与质粒pPICZ a A融合。根据含有米根霉脂肪酶基因 序列的质粒PPIC9K-R0L设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0047]Rl(5'-3'，下同）：CCGGAAITCATGGITCCTGmCTGGTAAATCTG，前面添加EcoRI酶 切位点。
[0048]R2:TCCCCGCGGATGATGATGATGATGATGCAAACAGCTTCCTTCGTTGATATCA，前面添加 SacII酶切位点及His-tag标签蛋白（下划线部分）。
[0049] 用合成的引物进行PCR扩增，PCR反应体系：1yL质粒pPIC9K-R0L，lyLR1引 物，lyLR2 引物，25yLPremixExtaq，22yLddH20。扩增条件为：变性 94°C，2min;变性 94°C，30s;退火55°C，lmin;延伸72°C，lmin;重复循环30次；延伸72°C，10min;反应停止， 4°C保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化，得到带有His-tag标签蛋白基因的米 根霉脂肪酶R0L基因。
[0050] 将米根霉脂肪酶R0L基因与pPICZaA用EcoRI和SacII酶切并纯化回收。用 T4DNA连接酶连接，构建表面展示重组质粒pPICZaA-R0L。
[0051]B.酵母表达载体pPICZaA-ROL-Histag-Sedlp的构建
[0052] (l)PCR扩增成熟的锚定蛋白基因Sedlp
[0053] 按照已知的酿酒酵母Sedlp蛋白的基因序列（GeneID:851649)设计引物，引物由 上海捷瑞生物工程有限公司合成。
[0054]SI:TCCCCGCGGCAATITTCCAACAGTACATCTGCTTCT，前面添加SacII酶切位点。
[0055]S2:CTAGTCTAGATTATAAGAATAACATAGCAACACCAGC，前面添加Xba I酶切位点。
[0056] 以提取的酿酒酵母EBY100基因组DNA为模板，用上述合成的引物进行PCR扩增。 PCR反应体系：lyL酿酒酵母EBY100基因组DNA，lyLS1引物，lyLS2引物，25yLPremix Extaq，22yLddH20。扩增条件为：变性 94°C，5min;变性 94°C，30s;退火 56°C，30s;延伸 72°C，lmin;重复循环30次；延伸72°C，10min;反应停止，4°C保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化，得到成熟的锚定蛋白基因Sedlp。
[0057] (2)将Sedlp与pPICZaA-R0L用SacII、XbaI酶切并用试剂盒纯化回收，用T4DNA 连接酶连接，得到重组巴斯德毕赤酵母表面展示表达质粒pPICZaA-ROL-Histag-Sedlp。 将得到的pPICZaA-ROL-Histag-Sedlp质粒转化大肠杆菌宿主T0P10F。用含50yg/ml ZeocinLLB平板筛选转化子，挑取Zeocin抗性阳性的转化子，提取质粒并测序，结果表明 壁蛋白sedlp基因序列正确插入。构建方法见图1(a)所示。
[0058] C?重组质粒pPICZaA-ROL-Histag-Sedlp在毕赤酵母中表达
[0059] 采用限制性内切酶SacI线性化质粒pPICZaA-ROL-Histag-Sedlp。电转化巴斯 德毕赤酵母GS115,在含100yg/mLZeocin的YPD平板上生长72h，挑取抗性阳性转化子， 即整合有融合基因序列的转化子，点至含400yg/mLZeocin的高抗YH)平板，挑选较大菌 株，即含有较多拷贝子的转化子。
[0060] 实施例3
[0061] 南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)毕赤酵母表面展示系统的构建，步骤如下：
[0062] A?表面展示重组质粒载体pGAPZaA-CALB构建
[0063] 克隆南极假丝酵母脂肪酶B基因CALB，与pGAPZaA融合。根据南极假丝酵母脂肪 酶B基因序列设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0064] Cl:CCGGAAITCATGAAGCTACTCTCTCTGACCGGTG，前面添加EcoRI酶切位点。
[0065] C2 :AAGGAAAAAAGCGGCCGCTGGGGGTGACGATGCCGGAGC，前面添加NotI酶切位点。
[0066] 以南极假丝酵母基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增）。PCR反应体系： lyL南极假丝酵母基因组DNA，lyLC1引物，lyLC2引物，25yLPremixExtaq，22yL ddH20。扩增条件为：变性 94°C，2min;变性 94°C，30s;退火 55°C，lmin;延伸 72°C，lmin;重 复循环30次；延伸72°C，lOmin;反应停止，4°C保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR产物进行 纯化，得到南极假丝酵母脂肪酶B基因。
[0067] 将南极假丝酵母脂肪酶B基因与pGAPZaA用EcoRI和NotI酶切并纯化回收。 用T4DNA连接酶连接，构建表面展示重组质粒pGAPZaA-CALB。
[0068] B.酵母表达载体pGAPZaA-CALB-Flag-Sedlp的构建
[0069] (1)PCR扩增成熟的锚定蛋白基因Sedlp
[0070] 按照已知