的酿酒酵母Sedlp蛋白的基因序列设计引物，引物由上海捷瑞生物工程 有限公司合成。
[0071] SCI：AAGGAAAAAAGCGGCCGCGATTACAAGGATGACGACGATAAGATGAAATTATCAACTGTCCTATT ATCT，前面添加NotI酶切位点和FLAG标签蛋白（下划线部分）。
[0072] SC2 :CTAGTCTAGAITATAAGAATAACATAGCAACACCAG，前面添加XbaI酶切位点。
[0073] 以提取的酿酒酵母EBY100基因组DNA为模板，用上述合成的引物进行PCR扩增。 PCR反应体系：lyL酿酒酵母EBY100基因组DNA，lyLSCI引物，lyLSC2引物，25yL PremixExtaq，22yLddH20。扩增条件为：变性94°C，5min;变性94°C，30s;退火56°C，30s; 延伸72°C，lmin;重复循环30次；延伸72°C，lOmin;反应停止，4°C保温。通过凝胶回收试 剂盒对PCR产物进行纯化，得到成熟的锚定蛋白基因Sedlp.
[0074] (2)将Sedlp与pGAPZaA-CALB用NotI和XbaI酶切并用试剂盒纯化回收，用T4 DNA连接酶连接，得到重组巴斯德毕赤酵母表面展示表达质粒pGAPZaA-CALB-Flag-Sedlp。 将得到的pGAPZaA-CALB-Flag-Sedlp质粒转化大肠杆菌宿主T0P10F。用含50 y g/ml Zeocin LLB平板筛选转化子，挑取Zeocin抗性阳性的转化子，提取质粒并测序，结果表明 壁蛋白Sedlp基因序列正确插入。构建方法见图1 (b)。
[0075] C?重组质粒pGAPZaA-CALB-Flag-Sedlp在毕赤酵母中表达
[0076] 采用限制性内切酶SacI线性化质粒pGAPZaA-CALB-Flag-Sedlp。电转化巴斯德 毕赤酵母GS115,在含100yg/mLZeocin的YPD平板上生长72h，挑取抗性阳性转化子，即 整合有融合基因序列的转化子，点至含400yg/mLZeocin的高抗YH)平板，挑选较大菌株， 即含有较多拷贝子的转化子。
[0077] 实施例4
[0078] 米根霉脂肪酶和南极假丝酵母脂肪酶B表面共展示重组基因工程菌的构建与鉴 定，步骤如下：
[0079] A.表面共展示重组基因工程菌GS115/pGAPZ a A-RCS的构建
[0080] 将表面展示米根霉脂肪酶（R0L)的重组毕赤酵母GS115/pPICZaA-R0L-Sedlp制 备感受态细胞。
[0081] 将表达载体pGAPZaA-CALB-Flag-Sedlp用限制性酶Sac I酶切线性化， 电泳检测线性化是否完全。表达载体经完全线性化后，转化至重组毕赤酵母GS115/ pPICZaA-R0L-Sedlp的感受态细胞，涂布于含Zeocin抗生素的YPDS平板。通过含不同浓 度的Zeocin抗生素的YPDS平板筛选得到高拷贝的重组菌。挑取转化子，点到一定浓度的 橄榄油-MMH-RB平板和三辛酸甘油酯平板上，挑取水解圈较大的菌（图2(a)，（b))，将表面 共展示菌株记为GS115/pGAPZaA-RCS，用于后续培养。
[0082] B.表面共展示重组基因工程菌GS115/pGAPZ a A-RCS的鉴定
[0083] (1)表面共展示重组基因工程菌的荧光分析
[0084]将阳性转化子GS115/pGAPZaA-RCS接种于 50mLBMGY培养基中，30°C，180rpm 振荡培养16_20h至0D_到2-6。离心收集菌体，再将其悬浮于BMMY培养基中，稀释至 〇D_为1，继续振荡培养，每隔24h向BMMY培养基中补加0.5 %的甲醇进行诱导表达。发 酵72h后，分别用anti-Histag及anti-Flag抗体进行免疫反应后，采用焚光显微镜对 GS115/pGAPZaA-RCS，GS115/pPICZaA-R0L-Sedlp，GS115/pGAPZaA-CALB-Sedlp和对照 菌株GS115进行分析比较。经过相同条件的培养诱导及荧光抗体孵育在紫外488nm和 555nm处的检测结果如图3。含组氨酸标签的脂肪酶重组菌GS115/pPICZaA-R0L-Sedlp 和GS115/pGAPZaA-RCS在488nm蓝光激发下呈现绿色荧光，而不含组氨酸标签的空白菌 GS115无法与荧光抗体结合，故无荧光显示。类似地，含Flag标签的脂肪酶重组菌GS115/ pGAPZaA-CALB-Sedlp和GS115/pGAPZaA-RCS在555nm绿光激发下呈现红色荧光，而不含 Flag标签的空白菌GS115无法与荧光抗体结合，故无荧光显示。此结果证明脂肪酶R0L和 CALB均成功的通过锚定蛋白Sedlp锚定展示在毕赤酵母细胞表面。
[0085] (2)表面共展示重组毕赤酵母细胞壁蛋白的分析
[0086] 摇瓶培养双脂肪酶共展示菌株GS115/pGAPZaA-RCS，再分别以空白菌株 毕赤酵母GS115、单一脂肪酶表面展示菌株GS115/pPICZaA-R0L-Sedlp和GS115/ pGAPZaA-CALB-Sedlp作为阴性对照。通过昆布多糖酶抽提出上述菌株的细胞壁蛋白，并 进行WesternBlot分析。结果如图4所示，图4(a)为采用抗His标签抗体免疫杂交的Western-blot结果。泳道 2, 3 分别为展示有R0L的重组菌GS115/pGAPZaA-RCS、GS115/ pPICZaA-ROL-Sedlp的细胞壁蛋白，有明显的一条带，大小为75kDa左右，和理论值一致， 此外泳道1的GS115菌细胞壁蛋白作为阴性对照，无条带形成。类似地，图4(b)为采用抗 Flag标签抗体免疫杂交的Western-blot结果。泳道1，2为展示有CALB的重组菌GS115/ pGAPZaA-RCS、GS115/pGAPZaA-CALB-Sedlp的细胞壁蛋白，同样在75kDa左右有明显的一 条带，和理论值一致，泳道3的GS115菌细胞壁蛋白作为阴性对照，无条带形成。此结果再 次证明了表面共展示重组毕赤酵母构建成功。
[0087] 实施例5
[0088] 表面共展示重组基因工程菌GS115/pGAPZ a A-RCS脂肪酶活性的测定，过程如下：
[0089] 摇瓶培养上述筛选双脂肪酶展示菌株GS115/pGAPZaA-RCS，以脂肪酶的最适反 应底物pNPD(4_nitrophenyldodecanoate)来考察菌株的最佳诱导时间和最高酶活力。 1000yL酶活测定体系：0. 05mol/LTris-HCLbufferpH7. 5850yL，稀释一定浓度的菌液 100yL,13. 5mmol/L的pNPD50yL。
[0090] 将重组菌株诱导表达144h后，6, 000g室温离心收集菌体，用50mMpH7. 5的PBS 缓冲液冲洗菌体3次，并最终重悬菌体于50mMpH7. 5的PBS缓冲液中。分别调整不同样品 的0D_= 50,初步获得共展示脂肪酶重组菌GS115/pGAPZaA-RCS，单独展示脂肪酶的重组 菌GS115/pPICZaA-R0L-Sedlp和GS115/pGAPZaA-CALB-Sedlp及对照菌株毕赤酵母GS115 的菌体悬液，并于在45°C，pH8. 0和适当的反应转速下反应15min。展示脂肪酶活力测定选 用吸光度法。1个酶活力单位（IU)定义为：每分钟水解底物对硝基苯酚酯pNH)所生成的 1ymol对硝基苯酚所需的酶量。
[0091] 如图5所示，展示在毕赤酵母表面的脂肪酶的酶活随着诱导时间的增大而增大， 表面共展示脂肪酶GS115/pGAPZ A-RCS培养至144h时活力最高，最高酶活达686U/g干细 胞，而单独表面展示R0L和CALB的脂肪酶活力分别是217U/g干细胞和379U/g干细胞，可 见表面共展示脂肪酶活力明显高于单独展示R0L和CALB的脂肪酶活力。
[0092] 实施例6
[0093] 表面共展示型全细胞催化剂催化油脂转酯化制备生物柴油，步骤如下：
[0094] A.表面共展示型全细胞催化剂的制备：表面共展示毕赤酵母工程菌所产酶分泌 在胞外，目标产物是菌体，诱导表达的目的是尽可能多的得到酶活高的细胞。重组毕赤酵母 工程菌诱导表达方法如下：
[0095] (1)对筛选得到的GS115/pGAPZaA-RCS基因工程菌在YPD平板上，30°C培养2d。 挑取单菌落接种于含150mLBMGY培