如表2所示。经同源性分析，筛选到3个高度保守的肽段：S卩，位于人肠道病毒蛋白2C内的 氨基酸序列AOl(肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170,对应于由肠道病毒基因组翻译的 氨基酸序列的aa1266-1281) :YSLProroHFDGYKQQ(SEQIDNO: 1);位于人肠道病毒蛋白3C 内的氨基酸序列A02(肠道病毒非结构蛋白3C的aa159-166,对应于由肠道病毒基因组翻 译的氨基酸序列的aa1707-1714) :GIHIGGNG;和位于人肠道病毒蛋白3D内的氨基酸序列 A03(肠道病毒非结构蛋白3D的aa297-307,对应于由肠道病毒基因组翻译的氨基酸序列 的aa2028-2038) :FNSMINNIIIR。这三个肽段的氨基酸序列（其肽段长度分别为16、8和 11个氨基酸）在65株病毒中均具有极高的保守性和同源性。特别地，这三个肽段各自的氨 基酸序列中，各个氨基酸位置的保守性大部分都超过90% (图1)。
[0139] 表2.氨基酸序列比对中选取的病毒株信息
[0142] 为方便起见，上述65株病毒的肠道病毒非结构蛋白2C的aa155-170分别提供于 SEQIDNO: 1 和 22-85(表 3)。
[0143] 表3. 65株病毒的非结构蛋白2C的aa155-170的氨基酸序列
[0144]
[0145]
[0146] 实施例2:人肠道病毒高保守多肽抗血清的制备
[0147] 根据实施例1中筛选到的三个肽段的氨基酸序列，设计合成了 3个多肽，编号 为：PA01(下文中也称为2C(aal55-170))、PA02和PA03(由上海博亚公司进行合成）。将 合成肽蛋白对6周龄BALB/c雌鼠进行免疫，每种展示肽平行免疫5只小鼠（编号为：鼠1 到鼠5)，免疫剂量为IOOiig/只小鼠，初免混合弗氏完全佐剂（购自Sigma)，以后每隔两 周加强一次，加强时混合弗氏不完全佐剂（购自Sigma)，共加强三针，在第三针加强后的第 11天米血。
[0148] 实施例3:鉴宙人肠道病毒高保守多肽抗血清与人肠道病毒的结合活件
[0149] 将实施例2中的多肽抗血清对不同代表性的肠道病毒采用免疫荧光进行检测。我 们选择了JS06-52-3、TW07-00190、XM08-2035、141 (CA6)、09-5428 (CB5)和PVl六种代表性 肠道病毒（这些肠道病毒均来自厦门CDC或台湾CDC)，免疫荧光方法步骤如下：
[0150] 将培养在含10 %FBS(PAA)的MEM(GIBCO)培养基中的RD细胞以4XIO5AiL的密 度铺于24孔细胞培养板（NUNC)中，2XIO5/孔；12h后，每孔感染20000TCID5。的肠道病毒； 12h后吸去培养基，用固定液（含有4%多聚甲醛的PBS溶液）固定，室温避光静置30min; 30min后吸去固定液，加入1 %TritonX-100溶液通透细胞，室温静置IOmin;IOmin后吸去 通透液，加入PBS溶液洗细胞三次，再将PBS溶液吸弃；加入封闭液（含有4%胎牛血清的 PBS溶液）封闭，放置于37°C中反应Ih;lh后吸去封闭液，加入以1:200稀释的多肽免疫 抗血清，放置于37 °C中反应Ih;Ih后吸去血清，加入PBS溶液洗细胞三次，再将PBS溶液吸 弃；加入FITC偶联的羊抗鼠抗体，以1:500稀释，放置于37°C中反应0. 5h;0. 5h后吸去抗 血清，加入PBS溶液洗细胞三次，再将PBS溶液吸弃；加入DAPI，以1:2000稀释，室温避光 静置5min;5min后吸去DAPI，加入PBS溶液洗细胞三次，再将PBS溶液吸弃；封片后在荧光 显微镜下进行结果观察。结果示于图2中。
[0151] 图2的结果显示，仅针对多肽PAOl的抗血清能够交叉结合六种代表性肠道病毒感 染的RD细胞，显示出绿色荧光；而针对多肽PA02或PA03的抗血清不能交叉结合六种代表 性肠道病毒感染的RD细胞，未显示出绿色荧光。这一结果表明：（1)抗多肽PA01(即多肽 2C(aal55-170))的免疫血清能够特异性交叉结合不同亚型的肠道病毒；多肽PAOl可能含 有广谱亲和表位；和，（2)抗多肽PA02或PA03的免疫血清无法特异性交叉结合不同亚型 的肠道病毒；多肽PA02和PA03不含广谱亲和表位。这些结果还表明，并非所有的保守性肽 段都包含广谱亲和表位。相反地，在很多情况下，保守性肽段（例如PA02和PA03)不能用 作广谱亲和表位，无法诱发广谱亲和抗体的产生。基于上述实验结果，选择2C(aal55-170) 多肽用于进行下一步实验。
[0152] 上述六种代表性肠道病毒的GenBank登录号如下：
[0153]JS06-52-3(EV71) ：FJ600325〇
[0154]TW07-00190(CA16) :JF420566。
[0155]XM08-2035(CB3) ：JQ042700〇
[0156] 141 (CA6)JF420565
[0157] 09-5428 (CB5)JQ042699
[0158]PVl：V01149.l〇
[0159] 实施例4:人肠道病毒广谱亲和多肽抗血清用于检测人肠道病毒的感染和滴度
[0160] 在稀释度足够的情况下，肠道病毒感染细胞后通过酶联免疫斑点法可以使被感染 细胞带有能够被Elispot检测的信号，带有信号的阳性细胞数即被感染细胞数可以认为是 在该次感染实验中使用了多少感染单位的肠道病毒。我们以梯度稀释斑点计数方法检测肠 道病毒的滴度。本实施例中我们选择了实施例3中的六种肠道病毒，进行感染滴度的测定。 具体步骤如下：
[0161] 将RD细胞铺于96孔细胞培养板中，2XIO4个/孔，培养基为MEM培养基。37°C培 养10小时。取病毒培养原液一份，用无血清MEM培养基10倍连续稀释4个梯度，最终使每 100yL培养基中分别含有100yL、10yL、IyL、0.IyL、0. 01yL5个浓度梯度的病毒稀释 液。将各梯度的病毒稀释液取50yL加入预铺于96孔细胞培养板中的RD细胞中，每个梯 度采取4孔重复。将96孔板放入37°C培养。培养14小时后，酶联免疫斑点法检测：
[0162] (1)吸去各孔中的培养基，每孔中加入100yL固定液（含有0. 2%戊二醛的PBS 溶液），室温避光静置Ih。
[0163] (2)Ih后吸去固定液，每孔中加入IOOyL1%TritonX-100溶液通透细胞，室温 静置0. 5h。
[0164] (3) 0. 5h后吸去通透液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃。
[0165] (4)在每个孔中加入100yL2C(aal55-170)多肽抗血清，多肽抗血清用酶稀（成 分为20mMPBS+0. 5%酪蛋白+2%明胶+0. 1%防腐剂的缓冲液，下同）稀释10000倍使用， 放置于37 °C中反应Ih。
[0166] (5)每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃。在每个孔中加入 100yL酶标记的羊抗鼠单克隆抗体GAM-HRP，酶标抗体GAM-HRP(1. 9mg/mL)用酶稀稀释 10000倍使用，放置于37 °C中反应Ih。
[0167] (6)Ih后吸去反应液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在 每个孔中加入1〇〇^111^显色液，放置在37°(：中显色15111111。
[0168] (7) 15min后吸弃板中的显色液终止显色。
[0169](8)启动斑点检测仪器ELISP0T(型号：Series3B)，将进行显色反应后的细胞培养 板放在仪器的取样板上，用仪器检测每个孔中的蓝色细胞数即被感染细胞数。ELISP0T的详 细操作步骤见该仪器的操作说明书。
[0170] (9)实验对照为未进行感染实验的RD细胞。
[0171] 肠道病毒效价计算方法：感染效价（IU/mL)=检测孔被感染细胞数/检测孔病毒 原液用量（mL)。其中，检测孔被感染细胞数=检测孔平均显色细胞数-阴性孔平均显色细 胞数。上述公式中"检测孔被感染细胞数"和"检测孔病毒原液用量"选择被感染细胞数最 接近于50且不低于50的检测孔的被感染细胞数与其对应的肠道病毒原液的用量。
[0172] 本实施例选择JS06-52-3 (EV71)病毒进行效价检测，结果如表4所示，病毒原液用 量对应的为被感染细胞的数量（为4孔平均值），代入上述公式即可计算获得该病毒效价为 3. 73XIO5(IU/mL) 〇
[0173] 表4.肠道病毒的感染用量与对应孔被感染细胞数的关系
[0174]
[0175]实施例5:人肠道病毒广谱亲和多肽抗血清用于检测人肠道病毒中和抗体效价
[0176] 本实施例中我们将2C(aal55_170)多肽抗血清用于酶联免疫斑点法，检测人肠道 病毒中和抗体效价。该方法具有高效、准确的优点，同时更有利于提高工作效率，更适合于 对不同亚型的肠道病毒进行高通量检测。具体方法描述如下：
[0177] (1)将RD细胞铺于96孔细胞培养板中（2XIO4/孔）。
[0178](2) 10小时后将待检测的样品（单克隆抗体样品、血清样品、腹水样品、细胞培养 上清液样品、细胞裂解液样品等）用无血清MEM进行梯度稀释（以单抗原液起点，进行2倍 比稀释，稀释8个梯度）。
[0179] (3)各孔取50yL与50yL稀释于无血清MEM的肠道病毒（5000TCID50)混合。 37°C混合孵育2小时。
[0180] (4)加入预铺RD细胞的96孔细胞培养板中，培养14小时后进行酶联免疫斑点反 应。
[0181] (5)吸去各孔中的培养基，每孔加入IOOy L固定液（含有0.2%戊二醛的PBS溶 液），室温避光静置Ih。
[0182] (6)吸去固定液，每孔中加入100 y L 1% Triton X-100溶液通透细胞，室温静置 30min〇
[0183] (7)吸去通透液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃。
[0184] (8)在每个孔中加入100 y L 2C(aal55-170)多肽抗血清，多肽抗血清用酶稀稀释 10000倍使用，放置于37 °C中反应Ih。
[0185] (9)每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃。在每个孔中加入 100yL酶标记的羊抗鼠单克隆抗体GAM-HRP，酶标抗体GAM-HRP(I. 9mg/mL)用酶稀稀释 10000倍使用，放置于37 °C中反应Ih。
[0186] (10)吸去反应液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃。在每个 孔中加入1〇〇^111^显色液，放置在37°(：中显色15111111。
[0187] (11)吸弃板中的显色液，终止显色。
[0188] (12)启动斑点检测仪器ELISP0T，检测每个孔中的蓝色细胞数即被感染细胞数。 详细操作步骤见ELISP0T仪器的操作说明书。
[0189] (13)未进行感染实验的RD细胞作为阴性孔，只进行EV71感染的RD细胞为阳性 孔，每个96孔板各设置5个孔。
[0190] (14)以达到50%感染抑制率以上的最大稀释倍数作为该样品的中和效价。
[0191] (15)各样品的感染抑制率=(1-样品孔被感染细胞数八阳性孔显色细胞数总 和/5-阴性孔显色细胞数总和/5))X100%。样品孔被感染细胞数=样品孔平均显色细胞 数-阴性孔显色细胞数总和/5。
[0192] 本实施例随机选取了 5份江苏疾病预防控制中心（⑶C)的手足口病（HFMD)病人 血清分别进行EV71、CVA16、CVB3的中和检测。HFMD病人的血清样品中和抗体的检测结果 显示（表5)，病人血清能够中和EV71、CVA16及CVB3中的一种或几种。
[0193] 表5.临床血清背景资料及中和抗体滴度检测结果
[0194]
[0195]实施例6:人肠道病毒广谱亲和表位多肽与HBVcAg蛋白的融合表汰
[0196]I.pT0-T7-C149表达载体的构建
[0197] 本领域人员知悉，HBcAg有着很强的T细胞免疫原性，外源多肽在HBcAg内部 MIR(mayorimmunodominantregion，78_83aa)的融合不会改变其颗粒的多聚特性、抗原 活性和免疫原性，且可使外源表位暴露于颗粒表面（参考文献Fu，T.M.，K.M.Grimm，et al. (2009) ?"ComparativeimmunogenicityevaluationsofinfluenzaAvirus M2peptideasrecombinantviruslikeparticleorconjugatevaccinesinmice andmonkeys."Vaccine27 (9) :1440-1447 ;Jin，H.，W.Xiao,etal. (2007)."Protective immuneresponsesagainstfoot-and-mouthdiseasevirusbyvaccinationwitha DNAvaccineexpressingvirus-likeparticles.''ViralImmunol20 (3) : 429-440 ;和 Yin,Y. ,J.Xu,etal. (2010)?"[HepatitisBviruscoreproteinasanepitopevaccine carrier:areview].^ShengWuGongChengXueBao26(4):431-438)〇
[0198] HBcAg的氨基酸序列可参见GenBankNo.AAF82721.I，具体如下：
[0199]MQLFHLCLIISCSCPTVQASKLCLGWLffGMDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALY REALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATffVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLffFHISCLTFGRE TVLEYLVSFGVffIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVVRRRCRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC(SEQID NO:11)〇
[0200] 其中HBcAg的l_149aa在大肠杆菌中能以类病毒颗粒形式表达，其氨基酸序列参 见GenBankNo.AF233235,具体如下：
[0204] 利用HBcAg的aa1-149在大肠杆菌中能以类病毒颗粒形式表达的性质，本发明人 将该149氨基酸插入大肠杆菌表达载体pT0-T7 (此载体的制备步骤见参考文献罗文新，张 军，杨海杰等，一种带增强子的原核高效表达载体的构建及初步应用[J]。生物工程学报， 2000,16 (5) :578-581)(也可以使用其它本领域常用的大肠杆菌表达载体）中，并以连接子 (GGGGSGGGGTGSFEFGGGGSGGGG(SEQIDN0:6))替代HBcAgB细胞优势表位区段的第 79、80 两个氨基酸（其对应氨基酸为PA)，并在265nt- 270nt处引入GGATCC，274nt- 279nt处 引入GAATTC(相对pT0-T7-C149)以引入两个限制性内切酶识别位点（BamHI和EcoRI) 构建了突变型HBc表达质粒pT0-T7-C149。外源蛋白在C149第93个氨基酸处插入。
[0205] 对肠道病毒非结构蛋白2C(aal55_170)区段进行引物设计（表6)，插入HBcAg蛋 白中得到的融合蛋白称为C149-2C(aal55-170)。
[0206] 肠道病毒（JS06-52_3(EV71))非结构蛋白2C的氨基酸序列如下：
[0207]SASWLKKFNDMANAAKGLEffVSNKISKFIDWLKEKIVPAAKEKVEFLNNLKQLPLLENQISNLEQSAAS QEDLEVMFGNVSYLAHFCRKFQPLYATEAKRVYALEKRMNNYMQFKSKHRIEPVCLIIRGSPGTGKSLATGIIARAI ADKYHSSVYSLPPDPDHFDGYKQQVVTVMDDLCQNPDGKDMSLFCQMVSTVDFIPPMASLEEKGVSFTSKFVIASTN ASNIIVPTVSDSDAIRRRFYMDCDIEVTDSYKTDLGRLDAGRAAKLCSENNTANFKRCSPLVCGKAIQLRDRKSKVR YSVDTWSELIREYSNRSAIGNTIEALFQ(SEQIDN0:10)。
[0208] 表6 :C149-2C(aal55_170)表面多肽融合蛋白的克隆引物序列
[0209]
[0211] 对合成2C(aal55_1