elles/C6 组的 tmax = 15min,AUC(0_t)=4.13ngg:h ； R1-BK+Mi ce 11 e/C6 组的 tmax = 15min, AUC(O-t) = 5.96ngg 1Ii0
[0027]图5=R1-BK与载紫杉醇胶束联合使用治疗原位脑胶质瘤模型裸鼠的生存曲线，其中，生理盐水组、载紫杉醇的PEG-PLA和R1-BK与载紫杉醇的PEG-PLA胶束联合给药组平均生存时间为22、22和31天。
【具体实施方式】
[0028]通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但并不限制本发明的内容。
[0029]实施例1R1-BK，R1-KD和R1-L-BK的制备与表征
[0030]采用固相合成法，将PAM-Boc树脂用三氟乙酸(TFA)脱保护I分钟，两次，用Boc保护氨基酸依次反应，反应完成后，三氟乙酸脱Boc保护后，依次用DMF、DCM/MeOH(l/l)洗涤树脂，真空干燥，将树脂放入多肽切割管中，加入适量P-cresol，然后通入HF，冰浴搅拌反应lh，反应结束后减压抽去管中HF，冰乙醚洗涤沉淀3次，残余沉淀以20%乙腈溶解后旋蒸，用乙腈/水(含0.1 % TFA)体系分离纯化，HPLC和ES1-MS表征R1-BK，R1-KD和R1-L-BK的纯度和分子量；其HPLC图谱及质谱图如图1所示，R1-BK的Tri BK = 16.10min,Mff: 1060.4 ；R1-KD 的 Tri kd = 15.36min, MW: 1188.6 ；R1-L-BK 的 Tri L BK = 18.40min, MW: 1173.4 与计算结果相符。
[0031]实施例2
[0032]C6、HEK、U87、HUVEC 和 bEnd.3 细胞对 R1-BK-FITC 的摄取
[0033]将C6、U87、HUVEC和bEnd.3细胞分别接种于12孔板中，待细胞贴壁后24h，弃去含有血清的DMEM，每孔加入不含血清的DMEM以及R1-BK-FITC荧光素母液，控制荧光素终浓度均为5 X 10 6mol/L。继续培养2h后取出，用PBS洗两遍，甲醛固定15分钟，PBS洗两遍，DAPI染色10分钟，PBS洗两遍，最后加缓冲甘油，荧光显微镜拍照，试验结果表明，C6、U87、HUVEC对R1-BK-FITC均有显著摄取，bEncL 3对于R1-BK-FITC基本无摄取(如图2所示)。
[0034]实施例3
[0035]R1-BK, R1-KD和R1-L-BK抑制C6细胞对R1-BK-FITC摄取的荧光照片和流式检测结果
[0036]将C6细胞接种于12孔板中，待细胞贴壁后，弃去含有血清的DMEM，每孔加入不含血清的DMEM以及多肽R1-BK，R1-KD和R1-L-BK，控制多肽的终浓度均为5X 10 3mol/L孵育半小时后，再加入R1-BK-FITC荧光素母液，控制荧光素终浓度均为5 X 10 6mol/L ;继续培养2h后取出，用PBS洗两遍，甲醛固定15分钟，PBS洗两遍，DAPI染色10分钟，PBS洗两遍，最后加缓冲甘油；荧光显微镜拍照；试验结果如图3所示；同时，将C6细胞胰酶消化后，1000转/分钟离心5分钟，用PBS洗涤I次，再加PBS分散均匀后，用流式细胞仪定量检测，定量检测结果表明，多肽R1-BK，R1-KD和R1-L-BK均可显著抑制C6细胞对R1-BK-FITC的摄取(如图4所示)。
[0037]实施例4
[0038]R1-BK与PEG-PLA胶束联合给药在脑部的药时曲线
[0039]将50mgPEG-DSPE和60 μ g香豆素6，用3ml乙腈溶解，减压蒸馏，置真空干燥过夜，用HEPES溶液在37摄氏度下水化半小时，用10nm的滤膜过滤除去游离香豆素6，制备的得到包载了香豆素6的胶束。将荷原位瘤的小鼠分为Micelles/C6组和R1-BK+Micelles/C6组，每组27只小鼠。先对R1-BK+Micelles/C6组的小鼠通过尾静脉注射给30 μ g/kg的R1-BK，5分钟后再通过尾静脉注射100 μ I的包载了香豆素6的胶束。Micelles/C6组则直接通过尾静脉注射100 μ I的包载了香豆素6的胶束，在注射了载香豆素6的胶束后5min、lOmin、15min、30min、lh、2h、4h、8h、12h的时候处死小鼠，每个时间点处死3只小鼠，然后取出脑组织，去除脑部的血管，用蒸馏水清洗彻底。称脑重，加3倍量的去离子水，将组织剪碎，用200W间歇超声匀浆(超Is停ls，进行30s)称取脑组织500mg的匀浆于EP管中，力口入20 μ I内标溶液(20ng/ml的香豆素7甲醇液)，混匀后加入Iml正己烧，涡旋Imin到
1.5min。10000转离心5min,使两相分离完全,吸取有机相800ml,于40°C下用氮气吹干。加入100 μ I甲醇润旋lmin, 10000转离心5min,取10 μ I上清液进样,记录药物峰面积与内标峰面积比；通过标曲算出脑内香豆素6的浓度，实验结果如图4所示，Micelles/C6组的tmax = 15min, AUC(O-t) = 4.13ngg:h ； R1-BK+Mi ce 11 e/C6 组的 tmax = 15min, AUC(O-t)=5.96ngg 1Ii0 实施例 5
[0040]R1-BK与载紫杉醇胶束联合给药的体内药效学实验
[0041]PEG-PLA (20mg)溶解在3ml乙腈中，加入6mg紫杉醇，减压成膜2h，水化，0.22 μ m水膜过滤除去游离紫杉醇，制备得到包载紫杉醇的胶束，原位肿瘤模型裸鼠尾分为生理盐水组、Micelles/PTX组以及RI_BK+Micelles/PTX组，生理盐水组静脉注射100 μ I生理盐水，Micelles/PTX组静脉注射100 μ I载紫杉醇的PEG-PLA胶束，R1-BK+Micelles/PTX组先静脉注射30 μ g/kg静脉注射100 μ I载紫杉醇的PEG-PLA胶束，和生理盐水，紫杉醇制剂的给药剂量为6mg/kg，分别在肿瘤种植后第6、9、12、15、和18天给药，记录裸鼠的生存时间；结果显示，与其他组别相比，R1-BK与载紫杉醇PEG-PLA胶束联合给药组(R1-BK+Micelles/PTX组)显著延长原位肿瘤裸鼠生存时间，裸鼠生存曲线如图5所示。
【主权项】
1.具有缓激肽受体结合活性的多肽，其特征在于，所述的多肽其氨基酸序列分别为RFPSFGPPR, RFPSFGPPRK 和 RFPSFGPPRL，分别命名为 R1-BK，R1-KD 和 R1-L-BK ;所述序列中的氨基酸为D构型氨基酸。2.权利要求1所述的具有缓激肽受体结合活性的多肽在制备辅助治疗脑肿瘤疾病的药物中的用途。3.权利要求所述的具有缓激肽受体结合活性的多肽在制备治疗脑肿瘤的组合药物中的用途。4.按权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述的多肽通过与缓激肽受体结合打开血脑肿瘤屏障。5.按权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述的多肽增加抗肿瘤药物在脑肿瘤部位的蓄积，减少对正常脑组织的损伤。6.一种治疗脑肿瘤的组合药物，其特征在于，由权利要求1所述的具有缓激肽受体结合活性的多肽和抗肿瘤药物或包载了抗肿瘤药物的给药系统组成。7.按权利要求6所述的治疗脑肿瘤的组合药物，其特征在于，所述的包载了抗肿瘤药物的给药系统是包载了抗肿瘤药物的聚合物胶束、脂质体或纳米粒。8.按权利要求6所述的治疗脑肿瘤的组合药物，其特征在于，所述的包载了抗肿瘤药物的聚合物胶束选自PEG-DSPE、PEG-PLA、PEG-PLGA、PEG-PCL或PEG-聚谷氨酸聚合物胶束。9.按权利要求6所述的治疗脑肿瘤的组合药物，其特征在于，所述的包载的抗肿瘤药物选自紫杉醇，阿霉素或伊曲康唑。
【专利摘要】本发明属药学领域，涉及蛋白质多肽生物技术领域，具体涉及可与缓激肽受体特异性结合的多肽。本发明利用多肽序列翻转原理，以缓激肽为模板设计了氨基酸序列分别是：RI-BK为RFPSFGPPR；RI-KD为RFPSFGPPRK；RI-L-BK为RFPSFGPPRL的多肽，经实验表明，所述多肽对缓激肽受体具有高亲和性，能选择性打开血脑肿瘤屏障，显著提高药物在脑肿瘤部位的蓄积，延长脑胶质瘤原位模型裸鼠的生存期。本发明的多肽可用于制备化疗药物的辅助用药，以及与包包载肿瘤药物的聚合物胶束给药系统制备治疗脑肿瘤的组合药物。
【IPC分类】A61K9/107, A61K47/42, A61K9/127, C07K7/18, A61K38/08, A61P35/00, A61K9/14, A61P25/00
【公开号】CN105085633
【申请号】CN201410199567
【发明人】刘敏, 谢作旭, 陆伟跃, 谢操, 李雪
【申请人】复旦大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月12日