构型进 一步通过E⑶试验确定，理论值与实验值基本一致（图2)。
[0029] 实施例2:化合物（I)药理作用试验
[0030] 一、材料和仪器
[0031]Αβ25 35贝勾于美国sigma公司。化合物（I)自制，制备方法见实施例1，HPLC归一 化纯度大于98%。MTT(四唑氮蓝）购于美国Amresco公司。LDH测定试剂盒购于南京建成 生物有限公司。吖啶橙（A0)购于美国sigma公司。溴化乙啶（EB)购于美国sigma公司。 RNase酶购于美国sigma公司。蛋白酶K购于美国sigmaAnnexin公司。V-FITC细胞凋亡 检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。D-MEM/F12培养基干粉购于美国GibcoL 公司。马血清购于美国hycLon公司。胎牛血清购于杭州四季青生物工程有限公司。多聚 赖氨酸（PLL)购于美国sigma公司。
[0032]低温高速离心机（美国Heraeus)，二氧化碳培养箱（美国SHELL/JB)，超净工作 台（苏州净化设备厂），雷勃MK3酶标仪（芬兰Thermolabsystems)，焚光显微镜（德国 Leica)，流式细胞仪EpicsXL(美国CouLter公司），电泳系统（北京六一仪器厂），雷勃MK3 酶标仪（芬兰Thermolabsystems)，焚光显微镜（德国Leica)，流式细胞仪EpicsXL(美国 CouLter公司），电泳系统（北京六一仪器厂）。
[0033] 二、试验方法
[0034] 1、细胞培养
[0035] ?(：12细胞生长于含10%马血清、5%胎牛血清的0-1^1作12培养液（37°(：，体积分 数为〇. 05的C02，饱和湿度），常规传代。实验时培养器皿用0. 005%PLL溶液（分子量为 150000-300000)包被，增加PC12细胞对培养器皿黏附力。
[0036] 2、Αβ25 35凝聚态处理
[0037] Αβ25 35溶于无菌双蒸水，终浓度为2. 0mm〇l/L，分装，_20°C保存，临用前，37°C孵育 4-7d〇
[0038] 3、药物对PC12细胞的处理
[0039] 对数生长期的PC12细胞按一定的密度分别接种于培养板中，待其生长稳定后，将 细胞分组，即对照组，Αβ25 35$导凋亡组以及化合物（I)干涉Αβ25 35诱导凋亡组。其中 Αβ25 35诱导凋亡组，以培养液加入凝聚态的Αβ25 35储存液，配制一定浓度的工作液，分别 加入细胞培养板，每孔再分别加入细胞悬液，C02培养箱培养。每小组均设3个平行孔；其 次依据2〇以!11〇1/1^0 25 35，设定化合物（1)干涉凋亡组，细胞以不同浓度化合物（1)预 处理lh，再分别予终浓度20μmol/LAβ25 35培养。
[0040] 4、ΜΤΤ法测定细胞存活率
[0041] 取对数生长期的细胞以2-5Χ 105/mL的初始浓度分别接种于96孔培养板中每孔 160 μ L，待其生长稳定后，加入不同浓度的Αβ25 35，细胞对照组只加等量培养液，每组设三 个平行孔。培养96小时，每孔加5mg/mL的ΜΤΤ溶液（PBS配制）20 μL，混匀后继续培养4h， 弃上清液，每孔加DMS00.2mL，振荡lOmin，以空白对照孔调零，在490nm波长下测定各孔光 密度值。
[0042] 5、LDH释放量的测定
[0043] 接种于24孔细胞培养板的细胞，经药物处理48h后，吸出各组上清液备用，各组细 胞加入0. 1 %NP-401mL作用lOmin，收集上清液备用。按照LDH测定试剂盒说明，分别检测 各组上清液和〇· 1 %NP-40的LDH活性，LDH释放率=0D上清A〇D上清+0D。. 1%NP4。）X100 %。
[0044]6、流式细胞分析细胞凋亡
[0045] 按AnnexinVFITC试剂盒说明操作：
[0046] (1)细胞处理一定时间后，2000rpm/min离心5min，细胞数1 一 5X105;
[0047] (2)用PBS清洗细胞二次，2000rpm离心 5min;
[0048] (3)加入500μLBindingbuffer悬浮细胞；
[0049](4)加入2μLAnnexinV-FITC混勾后，加入5μLPropidiumIodide(PI)，混勾，室 温，避光反应20min;
[0050] (5)流式细胞仪（BackmancoulterEpicsXL)检测，激发波长488nm，发射光 530nm.，对散点图进行分析。
[0051] 7、统计分析
[0052] 结果用均数土标准差:(>ts)表示，两两比较用t检验，P〈0. 05认为有统计学意义。
[0053] 三、结果及结论
[0054] 1、MTT测定Αβ25 35对PC12细胞活性的影响
[0055] 从图3可看出，Αβ25 35处理PC12细胞4d后，ΜΤΤ法检测显示20,40μmol/LAβ25 35 作用组吸光值（Α490)明显降低，差别有统计学意义（Ρ〈0. 05)。ΜΤΤ法检测表示线粒体功能， 结果说明Αβ25 35使PC12细胞线粒体功能降低，活细胞数减少，即Αβ25 35对PC12细胞的活 性有抑制作用，并与作用浓度相关。结果见表1及图3。
[0056] 表1Αβ25 35对PC12细胞生长的抑制作用（[讀
[0057]
[0058]2、LDH释放量测定
[0059] 10、20、40μ mol/ΙΑβ25 35作用PC12细胞48h后，通过检测细胞LDH释放率显示 细胞的损伤程度，结果表明Αβ25 35对PC12细胞的毒性作用，并与作用的浓度相关，20、 40μmol/LΑβ25 35作用组与对照组比较，差别有统计学意义（图4)。选20μmol/LΑβ25 35 作为损伤组，观察化合物（I)的干预作用，作用48h，结果表明，10ng/mL化合物（I)即 能降低PC12细胞LDH释放率，但差异不显著；100ng/mL，1000ng/mL化合物（I)组明显降 低PC12细胞LDH释放率【图5 ;标号意义：1、control ;2、20ymol/L Αβ 25 35;3、20μπιο1/1 八0 25 35+1.〇118/11^化合物（1);4、2〇41]1〇1凡厶0 25 35+1〇1^/1]11^化合物（1);5、2〇41]1〇1/ L AP 25 35+100ng/mL化合物（I) ;6、20ymol/L AP 25 35+1000ng/mL化合物（I);其中4、 5、6三组与20ymol/L Αβ 2535组比较ρ〈0·05】。
[0060] 3、AnnexinV-PI染色的流式细胞法检测细胞凋亡
[0061] 各组PC12细胞经处理后上流式细胞仪，并对散点图进行分析（MuLticycL软件处 理），显示对照组、10μmol/LΑβ25 35、20μmol/LΑβ25 35作用48h后，PC12细胞的凋亡率分 别为2. 1±0. 3%，9. 3±0. 5%和18. 6±3. 4%，凋亡率与Αβ25 35剂量成正相关，与对照组比 较差别具有显著性意义，以lOOng/mL化合物（I )预先处理，凋亡率降低为11. 2±3. 7%， 差别有统计学意义（表2,与对照组比较，* :P〈0. 05, # :P〈0. 01 ;与20ymol/LΑβ25 35组 比较，#:Ρ〈〇· 05)，显示化合物（I )抗Αβ25 35致凋亡作用。
[0062] 表2流式细胞术检测PC12细胞凋亡率（its，η= 3)
[0063]
[0064] 总结，本研究发现应用20μmol/LΑβ25 35能有效建立体外培养的大鼠嗜铬瘤细胞 株PC12凋亡模型；化合物（I)能部分对抗Αβ25 35诱导的PC12凋亡。
[0065] 实施例3
[0066] 片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:7 的比例加入赋形剂，制粒压片。
[0067] 实施例4
[0068] 口服液的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成 口服液。
[0069] 实施例5
[0070] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒 石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0071] 实施例6
[0072] 注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精 滤，灌封灭菌制成注射液。
[0073] 实施例7
[0074] 无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、 或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用 水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔 封得粉针剂。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I):2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含W下操作步骤：（a)将 积实的干燥幼果粉碎，用65~75%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用 石油酸、乙酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下 醇萃取物；（b)步骤（a)中正下醇取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体积，再 用70%乙醇洗脱8个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（C)步 骤（b)中70%乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为40:1、20:1、10:1和5:1 的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步骤（C)中组分4用正相硅胶进一步分 离，依次用体积比为8:1、5:1和2:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步 骤（d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为65%的甲醇水 溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：步骤（a)中，用70% 乙醇热回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为 D101型大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物 (I)和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备神经保护的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备神经保护的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种新的柠檬苦素类化合物及其制备方法和医药用途，属于药物技术领域。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的柠檬苦素化合物，可以从枳实的干燥幼果中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物能够对抗Aβ25-35诱导的PC12凋亡，可以用来开发成神经保护的药物。
【IPC分类】C07J73/00, A61K31/585, A61P25/00
【公开号】CN105237612
【申请号】CN201510732987
【发明人】庄立
【申请人】庄立
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年11月2日