SDS-PAGE2XLoadingbufferlOOμL，沉淀用 2mLPBS重悬后也吸取 100μL加入 100μL的 2XLoadingbuffer处理，SDS-PAGE或-20°C保存。
[0109] 3.表达形式分析
[0110] 将诱导前和诱导后收集的菌体以及收菌后破碎菌体进行SDS-PAGE，胶浓度为 15%，结果见图3,所表达的目的蛋白主要位于上清液中，表明目的蛋白以可溶性形式表达。
[0111] 1)SDS-PAGE
[0112] 样品处理：将已加Loading buffer的样品沸水浴8分钟，500rpm离心30s。
[0113] 上样：每孔上样量10μL，先80V电压电泳约25min，待溴酚蓝指示剂进入分离胶层 后加大电压至120V，电泳直至阳极外层电泳液变蓝。
[0114] 染色：将凝胶浸泡到考马斯亮蓝染液，置摇床上振荡染色30min。
[0115] 脱色：回收染色液，用自来水清洗掉染色液后加入脱色液，振荡脱色6小时以上。
[0116] 拍照及分析：凝胶用凝胶成像系统拍照，分析。
[0117]2)表达产物Western blot验证
[0118] 取表达载体pcoldll-LTRG经诱导后菌体进行蛋白免疫印迹实验，验证产物是否 目的蛋白。按常规方法进行15%分离胶和5%浓缩胶的SDS-PAGE电泳，转印到NC膜上，用 5%脱脂奶粉4°C封闭过夜，以羊抗CTB单抗和抗His-tag单抗为一抗，HRP标记兔抗山羊 IgG和羊抗鼠IgG为二抗，膜型DAB进行显色，见图4,结果均在目的蛋白大小的位置出现了 黑色印迹，表明表达出的蛋白正是目的蛋白。具体过程如下：
[0119] 取胶：SDS-PAGE电泳结束后取出凝胶，裁切下需要的部分，置转印缓冲液中浸泡。
[0120] 剪膜：剪下与凝胶大小相同的NC膜和6张Whatman滤纸，与纤维垫一起置转印缓 冲液中浸泡。
[0121] 装好转印装置，NC膜位于胶偏向正极的那面，向转印槽内注满转印缓冲液，冰浴条 件下100V电压转印1小时。
[0122] 洗膜：转印完成后将膜卸下，用TBS溶液洗膜5~lOmin;
[0123] 封闭：将膜用TTBS在4度封闭过夜；
[0124] 洗膜：用TTBS洗膜，两次，每次5~lOmin ;
[0125] -抗孵育：将膜于TTBS稀释的山羊抗CTB抗体溶液中，于37度恒温箱中孵育1. 5 小时；
[0126] 洗膜：用TTBS洗膜，两次，每次5~lOmin ;
[0127] 二抗孵育：将膜用TTBS稀释的兔抗山羊IgG抗体中，于37度恒温箱中孵育 45min；
[0128] 洗膜：用TTBS洗膜，两次，每次5~lOmin，最后用去TBS洗膜以除去膜表面的 Tween20 ；
[0129] 显色：按照增强型膜显色液的说明书进行，配制好显色液后滴加到膜上，待出现紫 色条带后用去离子水浸泡lOmin以终止显色，中间换水一次；
[0130] 干燥保存：在膜仍湿润时进行拍照，将膜置于滤纸上干燥后保存备查。
[0131] 4.目的蛋白的纯化
[0132] 由于在目的蛋白上引入了His标签而且以可溶形式表达，故在非变性条件下采用 重力法Ni柱亲和层析纯化，用咪唑梯度浓度洗脱获得纯化的目的蛋白，纯化过程中所用缓 冲液均预冷至4°C，以减少蛋白降解，成功获得了比较纯的重组LTRG蛋白，见图5,其中第6 泳道为纯化后的LTRG，可见两条条带，大小分别为30kd和15kd。
[0133] 具体过程如下：
[0134] 1)装柱：将1. 6X40cm规格的层析柱固定到旋转混匀仪上，保持下端出液口关闭， 加入20mL保存于20%乙醇的Ni-NTAresin，打开下端出液口使乙醇溶液流出。
[0135] 2)水清洗：加入30mL去离子水，关闭两端出口，开动旋转混匀仪5min，以5rpm速 度缓慢旋转使Ni-NTAresin与水充分混合，然后打开下端出液口使水流出，达到清洗目的， 重复清洗三次，每次30mL去离子水。
[0136] 3)平衡：用上样缓冲液平衡Ni柱，每次30mL，两次。
[0137] 4)上样：加入处理好的破碎上清20mL，开动旋转混匀仪1小时，使目的蛋白挂柱。
[0138] 5)清洗：排出破碎上清后用上样缓冲液清洗柱子两次，每次用上样缓冲液30mL， 收集清洗液。
[0139]6)咪唑梯度浓度清洗：用上样缓冲液和洗脱缓冲液配制含不同浓度咪唑的清洗 液，清洗柱子，清洗液中咪唑浓度逐步提高，分别用5 %，10 %，20 %，30 %，40 %，50 %，80 %， 100%洗脱缓冲液比例洗脱，每个浓度清洗两次，每次30mL，收集各梯度的洗脱液；其中上 样缓冲液是PBS缓冲液，100%洗脱缓冲液中咪唑的浓度为500mmol/L。
[0140] 7)平衡：100%洗脱缓冲液洗脱完毕后，用上样缓冲液平衡柱子至少3个体积。
[0141] 8)清洗：用去离子水洗层析柱两次，每次30mL，再用30mL20%乙醇清洗1次后加 入20mL20%乙醇，将Ni-NTAresin排出，置柱4°C保存。
[0142] 9)SDS-PAGE:将各阶段所取洗脱液分别取少量处理后进行SDS-PAGE，确定洗脱目 的蛋白所需咪唑浓度为125mmol/L~200mmol/L，取含纯化目的蛋白浓度较大的各管混合、 通过PEG透析浓缩分装保存于-80°C冰箱。
[0143] 最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的 技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在 本发明的权利要求范围中。
【主权项】
1. 一种重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的表达载体，其特征在于，其为利用冷 休克载体pcoldll与LTRG基因构建的表达载体pcoldll-LTRG，并且所述的LTRG基因的A 亚基C端和B亚基的N端上均引入了 His标签。2. 构建权利要求1所述的表达载体的方法，包括： 1) 设计引物：参照表达载体pcoldll的多克隆位点序列和LTRG基因序列设计引物，并 引入PstI和XhoI酶切位点； 2) 以质粒pET30a-LTRG为模板，进行PCR扩增，得到A亚基C端和B亚基的N端均带有 His标签的LTRG基因的目的片段； 3) 将冷休克载体pcoldll及步骤2)中的目的片段分别进行双酶切，再将酶切片段用连 接酶连接，获得表达载体pcoldll-LTRG，将其转化到克隆菌DH5a中扩增，并进行双酶切验 证。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的引物序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。4. 一种重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的制备方法，包括如下步骤： 1) 构建表达载体pcoldll-LTRG; 2) 将表达载体pcoldll-LTRG转化到BL21 (DE3)感受态菌中并进行IPTG诱导表达，添 加IPTG后，诱导温度为15~16°C，时间为12~24小时，获得目的蛋白； 3) 将目的蛋白在非变性条件下采用重力法Ni柱亲和层析进行纯化，用PBS缓冲液和 咪唑洗脱缓冲液配制清洗液，洗脱获得纯化的目的蛋白；纯化过程中所用缓冲液均预冷至 4 ~8。。。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3)的清洗液中咪唑洗脱缓冲液 的含量为25~40% (体积比），咪唑的浓度为125mmol/L~200mmol/L。
【专利摘要】本发明公开了一种重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白的表达及制备方法，通过设计引物，以质粒pET30a-LTRG为模板，进行PCR扩增，得到A亚基C端和B亚基的N端均带有His标签的重组大肠杆菌热敏性肠毒素突变体LTRG基因，选择冷休克载体pcoldII，构建出pcoldII-LTRG表达载体，并对其在低温条件下进行可溶性表达，之后采用Ni柱亲和层析纯化的方法对大量表达的蛋白质进行纯化。本发明利用冷休克基因CSPA获得高效的表达能力，进行诱导表达后，可溶性表达的产物不需进行变性和复性，省掉了蛋白质变性及复性的繁琐过程，避免了变性及复性过程中蛋白质的损失。
【IPC分类】C12N15/70, C12N15/66
【公开号】CN105238805
【申请号】CN201410331148
【发明人】刘惠莉, 哈卓, 殷秀辰
【申请人】上海市农业科学院, 上海佳牧生物制品有限公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2014年7月11日