细胞调亡的检测
[0039] 利用AnnexinV/PI双染流式细胞分析技术检测化合物（I)对乳腺癌细胞MCF-7、 MDA-MB-231、MDA-MB-453调亡的影响。实验严格按照AnnexinV调亡检测试剂盒操作说明 进行。具体操作为：将对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453常规传 代，细胞计数，Wl〇5/mL细胞浓度接种于6孔细胞培养板内，每孔5mU培养过夜，待细胞贴 壁且生长良好。实验分5组，每组作3个平行孔，分别加入不同剂量的化合物（I)，使其终 浓度分别为150、100、50mg/mU对照组加等量蒸馈水，培养2地，弃掉培养液，用4°C预冷的 PBS加7.。洗细胞3次，常规膜酶消化，制作单细胞悬液，离心用250yL稀释的binding 缓冲液重新悬浮细胞，并使其浓度为1Xl〇6/mU取100yL的细胞悬液于5mL流式管中，加 5yLAnnexinV/FITC溶液，静置5min，加入20yg/mL的PI溶液10yL混匀后于室溫避光 放置lOmin，在反应管中加400yLPBS,利用流式细胞仪上机检测各组巧光状况。细胞根据AnnexinV和PI染色情况分别分至4个相，AnnexinV和PI染色均阴性细胞为正常存活细 胞，PI染色阳性、AnnexinV染色阴性为机械损伤或破裂细胞，AnnexinV和PI染色均阳性为 坏死或晚期调亡细胞，AnnexinV染色阳性、PI染色阴性判定为早期调亡细胞。
[0040] 4、细胞线粒体膜电位的检测
[0041] 利用细胞线粒体膜电位分子探针JC-I和激光共聚焦扫描显微镜检测化合物（I) 对乳腺癌细胞MBA-MD-453线粒体膜电位的影响。具体操作为：将对数生长期的乳腺癌细胞 MDA-MB-453常规传代，细胞计数，Wl〇5/mL细胞浓度接种于6孔细胞培养板内，每孔5mU培 养过夜，待细胞贴壁且生长良好实验分5组，每组作3个平行孔，分别加入不同剂量的化合 物（1)，使其终浓度分别为150、100、50111旨/111以对照组加等量蒸馈水，培养2地，弃掉培养液， 用4°C预冷的PBS(抑7. 2)洗细胞3次，加入1.O血PBS，加入10yL2. 5mmol/L的JC-I，使其 终浓度为25ymol/l，在37°C、5 %C〇2培养箱内避光解育20min，用PBS洗涂3次，激光共聚 焦扫描显微镜检测分析。
[0042] 5、数据的统计分析
[0043] 所有数据均W平均数±标准差（X古S)表示，采用SPSS12.0统计软件，对实验结 果进行单因素方差分析，P<〇. 05认为两者间存在显著差异。
[0044]S、结果及结论 W45] 1、细胞增殖活力检测结果
[0046] 利用CCK-8法检测不同浓度化合物（I)作用对S种乳腺癌细胞增殖活力的影 响，结果表明，化合物（I)作用可使=种乳腺癌细胞增殖活性均降低，且随作用浓度的增 加降低程度增加，显示出剂量-效应关系，100、150和200mg/血组与对照组相比均出现显著 性差异（P<〇. 05,P<0. 01)，化合物（I)作用可显著抑制乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、 MDA-MB-453的增殖，显示出较强的体外细胞毒性，表明化合物（I)具有较强的体外抗乳腺 癌效应。结果见图3和表1。
[0047] 2、细胞调亡的检测结果
[0048] 利用AnnexinV/PI双染流式细胞分析技术检测化合物（I)对乳腺癌细胞MCF-7、 MDA-MB-23UMDA-MB-453调亡的影响，调亡分析结果显示，化合物（I)作用2地可使=种 乳腺癌细胞的调亡率均升高，显示出促调亡效应，且具有剂量-效应关系，100和150mg/mL 组与对照组相比具有显著差异（P<〇. 05)表明化合物（I)可显著诱导乳腺癌细胞调亡，发 挥抗肿瘤作用。结果见图4。 W例总结，本研究通过对化合物（I)抗乳腺癌作用研究，发现化合物（I)可使立种 乳腺癌细胞增殖活性降低，显著抑制其增殖，显示出较强的体外细胞毒性，具有体外抗乳腺 癌效应。
[0050] 表1不同剂量化合物（I)对乳腺癌细胞增殖的抑制率（％ )
[0051]
阳化2] 实施例3
[0053] 片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为 1:7的比例加入赋形剂，制粒压片。
[0054] 实施例4 阳化5] 口服液制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按常规口服液制法制成 口服液。
[0056] 实施例5
[0057] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如 酒石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按其与赋形剂 重量比为1:7的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。 阳0郎]实施例6
[0059] 注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石酸、 或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按常规加注射用水，精 滤，灌封灭菌制成注射液。 W60] 实施例7
[0061] 无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有机酸如酒石 酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，将其溶于无菌注射 用水中，揽拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安飯中，低溫冷冻干燥后无菌 烙封得粉针剂。
[0062] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不W此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可W对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a)将 枳壳的干燥未成熟果实粉碎，用75~85 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依 次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和 正丁醇萃取物；(b)步骤（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个 柱体积，再用75 %乙醇洗脱10个柱体积，收集75 %乙醇洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱 物浸膏；（c)步骤（b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、45:1、 25:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤（c)中组分4用正 相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3 个组分；（e)步骤（d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为 75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合 物（I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为D101 大孔吸附树脂。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：所述用乙醇热回流 提取采用的乙醇浓度为80 %。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物 (I)和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种用于治疗乳腺癌的新的柠檬苦素类化合物。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的柠檬苦素类化合物，可以从枳壳的干燥未成熟果实中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物使三种乳腺癌细胞增殖活性降低，显著抑制其增殖，具有体外抗乳腺癌效应，可以用来开发成治疗乳腺癌的药物。
【IPC分类】A61K31/585, C07J73/00, A61P35/00
【公开号】CN105294819
【申请号】CN201510687891
【发明人】高忠青
【申请人】淄博夸克医药技术有限公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年10月20日