其接种于细胞培养容器中；再取第3代培养72h的骨髓 间充质干细胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0. 25%胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以 1 X 109L 1浓度接种于上述含有三维细胞培养支架的细胞培养容器中。第一天半量换培养液 一次，之后的两天全部更换。
[0109] 其中，该步骤所采用的培养液为含有10%胎牛血清、10 6mol/L的氢化可的松、 100U/ml的青霉素及100mg/ml链霉素的低糖DMEM培养液。
[0110] 实施例9
[0111] 本实施例中，三维细胞培养支架是由胶原赖氨酸支架和脱细胞软骨组合而成的， 其中，胶原赖氨酸支架的制备方式见实施例3,脱细胞软骨的制备方式如上所述，在此不再 赘述；
[0112] 在该实施例中，取第三代骨髓间充质干细胞于三维细胞培养支架中进行培养的过 程，包括以下步骤：
[0113] 取胶原赖氨酸支架0. 5g、10ml的30g/L的脱细胞软骨于10ml的3 %乙酸和20ml 蒸馏水中复溶，然后将其接种于细胞培养容器中；再取第3代培养72h的骨髓间充质干细 胞，吸除旧培养液，用PBS冲洗2次，0. 25 %胰酶-EDTA常规消化并收集细胞，以1 X 109L 1浓 度接种于上述含有三维细胞培养支架的细胞培养容器中。第一天半量换培养液一次，之后 的两天全部更换。
[0114] 其中，该步骤所采用的培养液为含有10%胎牛血清、10 6mol/L的氢化可的松、 100U/ml的青霉素及100mg/ml链霉素的低糖DMEM培养液。
[0115] 为进一步验证本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法 的显著效果，通过以下实验及实验数据进行具体说明。
[0116] 检测对象：
[0117] 检测组1-9分别对应本发明实施例1-9骨髓间充质干细胞与三维细胞培养支架共 培养第3天所获得的细胞；
[0118] 对照组1-6-分别对应单独采用胶原支架、纳米晶胶原支架基骨、脱细胞软骨、壳 聚糖水凝胶、壳聚糖改性水凝胶和赖氨酸支架中任意一种培养骨髓间充质干细胞第3天所 获得的细胞；
[0119] 检测一、台盼蓝法进行细胞计数
[0120] 取检测组1-9及对照组1-6的细胞，分别执行以下操作：
[0121] 用75%酒精清洗计数板和盖玻片，用吸水纸擦干；在每次细胞补液前取10ul细 胞悬液和l〇ul的0. 4%苔盼蓝充分混合，再加80ul的PBS缓冲液稀释细胞悬液；吸取少 量细胞悬液，加入在计数板上的盖玻片内，一定注意不要溢出至计数板上的小槽内，也不 要过少或带气泡，在倒置显微镜下观察血球计数板上计数4个大方格内的细胞总数，并根 据以下公式计算出细胞密度：细胞悬液密度计算公式一细胞密度=(4个大格细胞总数 /4) X 104X 10 (稀释倍数）个/ml，具体数据见下表1。
[0122] 表1:
[0123]
[0124] 检测结果：由表1中的数据可知，检测组1-12中的细胞密度均远大于对照组1-6 中的细胞密度，由此说明，本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方 法提高了骨髓间充质干细胞的增殖率。
[0125] 检测二、流式细胞仪检测细胞表型⑶44,⑶90,⑶105的阳性率
[0127] 检测结果：由表二中的数据可知，检测组1-12均大于对照组1-6中的数据，由此说 明，检测组1-12所获得的骨髓间充质干细胞的活性较强。
[0128] 综上所述，本发明提供的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，通 过采用壳聚糖或赖氨酸，亦或是采用壳聚糖和戊二醛对胶原支架进行改性，以提高三维细 胞培养支架的机械性能，使其不易被酶解，并利用其三维多孔结构维持骨髓间充质干细胞 体外培养过程中的三维生长环境，以更好地模拟适宜骨髓间充质干细胞生长的骨髓微环 境，并提高三维细胞培养支架的细胞黏附性，使得骨髓间充质干细胞能够黏附在三维细胞 培养支架的多孔结构上生长，扩大了细胞与培养基的接触面积，从而达到提高骨髓间充质 干细胞的细胞活性及增值率，解决了现有技术中，采用单一三维细胞培养支架培养骨髓间 充质干细胞存在支架机械性能弱等缺陷造成细胞增殖率低、易死亡等问题。
[0129] 以上结合对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施 方式，上述的【具体实施方式】仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本 发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式， 这些均属于本发明的保护之内。
【主权项】
1. 一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步 骤： 获取骨髓间充质干细胞，采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养； 其中，所述三维细胞培养支架是由胶原和壳聚糖，或胶原和赖氨酸制成；或，所述三维 细胞培养支架是由胶原与壳聚糖和戊二醛三者共同制成的。2. 根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征 在于，所述三维细胞培养支架中还添加有纳米晶胶原基骨或脱细胞软骨。3. 根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征 在于，由所述胶原和壳聚糖制备三维细胞培养支架的过程包括以下步骤： 将胶原溶于乙酸溶液中，配制胶原溶胀液；将壳聚糖溶于乙酸中，配制壳聚糖溶液，然 后将胶原溶胀液和壳聚糖溶液混合脱泡，冷冻并冻干。4. 根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征 在于，由所述胶原和赖氨酸制备三维细胞培养支架的过程包括以下步骤： 将胶原溶于乙酸溶液中制成胶原溶胀液，经真空脱泡，冷冻并冻干处理后，浸泡于含有 赖氨酸的MES溶液中，然后再添加EDAC交联剂和含NHS氨基酸保护剂，交联处理后漂洗，然 后冷冻并干燥。5. 根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征 在于，由所述胶原、壳聚糖和戊二醛制备三维细胞培养支架的过程包括以下步骤： 将胶原溶于乙酸溶液中，配制成胶原溶胀液；并用乙酸溶液配制壳聚糖溶液，然后将 胶原溶胀液和壳聚糖溶液混合并放置于真空中干热交联后浸泡于戊二醛溶液中，继续交联 8-16个小时后，漂洗，冷冻并冻干。6. 根据权利要求1所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征 在于，获取骨髓间充质干细胞的步骤包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分离液中离心， 取中层单核细胞，PBS缓冲液离心洗涤，弃上清液，即收获原代骨髓间充质干细胞。7. 根据权利要求6所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特 征在于，获取骨髓间充质干细胞的步骤还包括对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养的过 程，包括以下步骤： 将原代骨髓间充质干细胞浓度调整至IX1〇6~IX10 8个/25ml，加入所述培养基进行 培养；当细胞生长到融合时，PBS漂洗，加入胰蛋白酶，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入 含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按1 :2~1 :3比例接种进行传代培养至细胞生长到融 合，继续传代至获得第三代骨髓间充质干细胞。8. 根据权利要求7所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特征 在于，采用三维细胞培养支架进行体外培养的步骤为：取三维细胞培养支架复溶，取第三代 骨髓间充质干细胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以1X10s~1X10w个/L细胞浓度与复溶 后三维细胞培养支架共同接种于所述培养基中进行培养。9. 根据权利要求4所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其 特征在于，三维细胞培养支架复溶过程中，还添加有助溶剂，且所述助溶剂的质量分数为 5% -15%〇10. 根据权利要求8所述的人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，其特 征在于，所述培养基为血清培养基，且所述血清培养基中添加有10 6~10smol/L的氢化可 的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的链霉素。
【专利摘要】本发明涉及一种人工模拟骨髓微环境培养骨髓间充质干细胞的方法，包括以下步骤：获取骨髓间充质干细胞，采用三维细胞培养支架于培养基中进行体外培养；其中，所述三维细胞培养支架是由胶原和壳聚糖或赖氨酸制成；或所述三维细胞培养支架是由胶原与壳聚糖和戊二醛制成的。通过采用壳聚糖或赖氨酸，亦或是壳聚糖和戊二醛对胶原支架进行改性，以提高胶原支架的机械性能，并利用其三维多孔结构维持骨髓间充质干细胞体外培养过程中的三维生长环境，以更好地模拟适宜骨髓间充质干细胞生长的骨髓微环境，解决了现有技术中，采用单一三维细胞培养支架培养骨髓间充质干细胞存在支架机械性能弱等缺陷造成细胞增殖率低、易死亡等问题。
【IPC分类】C12N5/0775
【公开号】CN105316285
【申请号】CN201510749897
【发明人】曾宪卓, 鲁菲
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月6日