; 28(8): 571-80);或公告号为 CN101338309B 的中国专利公开的可以生产青蒿酸的酿酒酵母(Saccharomyces cereKisiae),优选生物保藏号为CGMCCN0.1861的酿酒酵母。本发明所用溶剂如无特殊说明均为市售获得。
[0024]种子和发酵培养条件具体如下:
培养基组成:葡萄糖 19.5g/L，甲硫氨酸 0.25g/L，(NH4) 2S04 15g / L，KH2P04 8g / L，MgS04.7H20 6.15g / L，维生素溶液12mL / L，微量元素溶液lOmL / L。其中:
(1)维生素溶液组成:生物素0.05g/L，泛酸钙lg/L，烟酸lg/L，肌醇25g/L，硫胺素lg/L,烟酸卩比唆醇lg/L,对氨基苯甲酸0.2g/L ；
(2)微量元素溶液组成:ZnS04*7H20 5.75 g/L,MnCl2.4 H20 0.32g/L，无水CuS04 0.32g/L, CoCl2.6H20 0.47g/L, Na2Mo04.2 H20 0.48 g/L, CaCl2.2 H20 2.9 g/L, FeS04.7 H2.8g/L，0.5M EDTA 80 ml/L ；
种子瓶30°C下摇床220rpm培养24h ;发酵罐温度30°C，搅拌转速20(T800rpm，空气流量420L~840L/h，发酵全过程溶氧控制在20%以上。
[0025]下述实施例中测定发酵单位用的高效液相色谱为岛津公司生产，检测方法:Diamonsil C18色谱柱(250 mm * 4.6 mm, 5 mm ),柱温为30°C,流动相采用乙腈与0.2%磷酸水溶液混合液(体积比65: 35)，流速1 mL /m in，检测波长220 nm。
[0026]实施例1
将1ml冷冻保存的种子液接入含有100ml培养基的750ml摇瓶中，30°C培养24h，接入含有7L发酵培养基的发酵罐中培养，30°C，搅拌200rpm，空气流量420L/h，随着溶氧的变化增加搅拌速度和空气流量，控制溶氧在20%以上。发酵培养14h以后，开始补加葡萄糖和乙醇，葡萄糖浓度30%，按照每小时7ml (约为发酵液体积的0.1%)的速度加入；乙醇的浓度为70%，按照每小时14ml (约为发酵液体积的0.2%)的速度加入。
[0027]培养24h时，开始加入正己烷，补加速度70ml/ (1%)天，连续补加，直到140h，放罐，离心得有机相约300ml，HPLC检测，含有产品100.5g，平均发酵单位14.4g/L。
[0028]实施例2
将1ml冷冻保存的种子液接入含有100ml培养基的750ml摇瓶中，30°C培养24h，接入含有7L发酵培养基的发酵罐中培养，30°C，搅拌200rpm，空气流量420L/h，随着溶氧的变化增加搅拌速度和空气流量，控制溶氧在20%以上。发酵培养16h以后，开始补加葡萄糖和乙醇，葡萄糖浓度50%，按照每小时28ml (约为发酵液体积的0.4%)的速度加入；乙醇的浓度为95%，按照每小时35ml (约为发酵液体积的0.5%)的速度加入。
[0029]培养24h时，开始加入正己烷，补加速度210ml/ (3%)天，连续补加，直到140h，放罐，离心得有机相约950ml，HPLC检测，含有产品125.lg，平均发酵单位17.9g/L。
[0030]实施例3
将1ml冷冻保存的种子液接入含有100ml培养基的750ml摇瓶中，30°C培养24h，接入含有7L发酵培养基的发酵罐中培养，30°C，搅拌200rpm，空气流量420L/h，随着溶氧的变化增加搅拌速度和空气流量，控制溶氧在20%以上。发酵培养18h以后，开始补加葡萄糖和乙醇，葡萄糖浓度60%，按照每小时70ml (1%)的速度加入；乙醇的浓度为99.7%，按照每小时56ml (0.8%)的速度加入。
[0031]培养48h时，开始加入甲苯，补加速度350ml/ (5%)天，连续补加，直到140h，放罐，离心得有机相约1300ml，HPLC检测，含有产品104g，平均发酵单位14.8g/L。
[0032]实施例4
将1ml冷冻保存的种子液接入含有100ml培养基的750ml摇瓶中，30°C培养24h，接入含有7L发酵培养基的发酵罐中培养，30°C，搅拌200rpm，空气流量420L/h，随着溶氧的变化增加搅拌速度和空气流量，控制溶氧在20%以上。发酵培养16h以后，开始补加葡萄糖和乙醇，葡萄糖浓度50%，按照每小时70ml (1%)的速度加入；乙醇的浓度为95%，按照每小时56ml (0.8%)的速度加入。
[0033]培养36h时，开始加入正十二烷，补加速度210ml/ (3%)天，连续补加，直到140h，放罐，离心得有机相约900ml，HPLC检测，含有产品132g，平均发酵单位18.9g/L。
[0034]实施例5 将1ml冷冻保存的种子液接入含有100ml培养基的750ml摇瓶中，30°C培养24h，接入含有7L发酵培养基的发酵罐中培养，30°C，搅拌200rpm，空气流量420L/h，随着溶氧的变化增加搅拌速度和空气流量，控制溶氧在20%以上。发酵培养17h以后，开始补加葡萄糖和乙醇，葡萄糖浓度45%，按照每小时70ml (1%)的速度加入；乙醇的浓度为95%，按照每小时42ml (0.8%)的速度加入。
[0035]培养36h时，开始加入环己烷，补加速度210ml/ (3%)天，连续补加，直到140h，放罐，离心得有机相约860ml，HPLC检测，含有产品119g，平均发酵单位17 g/L。
[0036]实施例6
将1ml冷冻保存的种子液接入含有100ml培养基的750ml摇瓶中，30°C培养24h，接入含有7L发酵培养基的发酵罐中培养，30°C，搅拌200rpm，空气流量420L/h，随着溶氧的变化增加搅拌速度和空气流量，控制溶氧在20%以上。发酵培养16h以后，开始补加葡萄糖和乙醇，葡萄糖浓度50%，按照每小时35ml (1%)的速度加入；乙醇的浓度为95%，按照每小时42ml (0.8%)的速度加入。
[0037]培养36h时，开始加入甲基异丁基酮，补加速度210ml/ (3%)天，连续补加，直到140h，放罐，离心得有机相约820ml，HPLC检测，含有产品139.5g，平均发酵单位19.9 g/L。
[0038]对比例
将1ml冷冻保存的种子液接入含有100ml培养基的750ml摇瓶中，30°C培养24h，接入含有7L发酵培养基的发酵罐中培养，30°C，搅拌200rpm，空气流量420L/h，随着溶氧的变化增加搅拌速度和空气流量，控制溶氧在20%以上。发酵过程中根据溶氧高于30%补加葡萄糖溶液和乙醇，溶氧低于20%，停止补加，培养90h，发酵单位10.2g/L。
【主权项】
1.一种发酵生产青蒿酸的方法，包括以下步骤: 1)将种子液接入到含发酵培养基的发酵罐中培养，培养14~18小时后，向发酵罐中连续补加葡萄糖和乙醇至发酵结束； 2)培养24h~48h后，向发酵罐中补加水不溶性有机溶剂，连续补加至发酵结束； 3)发酵结束后，放罐，分离，得到含青蒿酸的有机相。2.如权利要求1所述方法，其中步骤1)将种子液接入到发酵罐中培养之前，先接入到摇瓶中。3.如权利要求1所述方法，其中步骤1)所补加的葡萄糖浓度为30%~60%，以流加方式加入到发酵罐中，每小时加入量为发酵液体积的0.1%~1%。4.如权利要求1所述方法，其中步骤1)所补加的乙醇浓度为70%~99.7%，以流加方式加入到发酵罐中，每小时加入量为发酵液体积的0.2%~0.8%。5.如权利要求1所述方法，其中步骤1)所补加的葡萄糖浓度为50%，以流加方式加入到发酵罐中，每小时加入量为发酵液体积的0.4% ;所补加的乙醇浓度为95%，以流加方式加入到发酵罐中，每小时加入量为发酵液体积的0.5%。6.如权利要求1所述方法，其中步骤2)所述水不溶性有机溶剂为烷烃类溶剂或芳香烃类溶剂。7.如权利要求6所述方法，其中所述烷烃类溶剂为(V12的烷烃；所述芳香烃类溶剂为甲苯、二甲苯、间二甲苯或对二甲苯。8.如权利要求1所述方法，其中步骤2)所述水不溶性有机溶剂还可以选自甲基异丁基酮。9.如权利要求1或6~8任一权利要求所述方法，其中水不溶性有机溶剂加入到发酵液中的体积为发酵液体积的4%~20%，加入速度为每天加入1%~5%的发酵液体积。10.如权利要求1所述方法制备的青蒿酸，其在制备青蒿素中的用途。
【专利摘要】本发明提供了一种发酵生产青蒿酸的方法，包括在发酵液中加入少量有机溶剂，将产物从发酵液中转入有机相中，达到延长生物合成的时间和效率，提高产量、简化提取工艺的目的。本发明所提供的技术方案减少了生产工序，提高生产效率，简单易行，适合于工业化生产。
【IPC分类】C12R1/865, C12P17/18
【公开号】CN105316372
【申请号】CN201410377262
【发明人】刘省伟, 别一, 郭明, 袁建栋
【申请人】重庆乾泰生物医药有限公司, 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2014年8月4日