036] 图7.不同浓度的5-氮杂胞苷（5-Aza)和5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5-Aza-dC)对 甲基转移酶活性的抑制作用。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
[0038] 原理
[0039] 哑铃分子探针（D-probe)的设计和整个工作原理（以M.SssI甲基转移酶为例）如 图1所示。首先，D-probe通过分子内的DNA杂交形成稳定的哑铃结构。D-probe莖部的红 色部分设计为5'-CCGG-3'的回文序列来识别M.SssI甲基转移酶和Hpall内切酶。M.SssI 甲基转移酶能够将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到5' -CCGG-3'的回文序列中的胞嘧啶 上，形成5'-CCmGG-3'。Hpall内切酶能够切割5'-CCGG-3'的双链回文序列，切割位点位于 胞嘧啶之间，但是胞嘧啶甲基环的回文序列不能被Hpall切割。此外，D-probe-个环部的 橘色部分含有5'-GTAC-3'的四核苷酸序列用于级联的滚环扩增。如图1，该M.SssI甲基转 移酶活性分析方法包括两部分的过程，一个是M.SssI甲基转移酶和Hpall内切酶的酶联识 别过程，另一个是级联的滚环扩增和信号产生的过程。第一部分中，当M.SssI甲基转移酶 不存在时，D-probe茎部的5' -CCGG-3'的回文序列能够被Hpall内切酶识别，并在胞嘧啶 之间切割为两部分。因此，随后的级联的滚环扩增过程被阻止，产生微不足道的荧光信号。 然而，当M.SssI甲基转移酶存在时，D-probe茎部的5' -CCGG-3'的回文序列中的胞嘧啶被 甲基化，形成5' -CCmGG-3'的回文序列，Hpall内切酶的切割被阻止，因此能够进行甲基化 保护的级联的滚环扩增过程（如下）。首先，甲基化保护的完整的D-probe与引物1 (P1)杂 交，并在phi29DNA聚合酶的作用下进行线性的滚环扩增，形成长的重复的D-probe的复制 体。然后，引物2 (P2)被加入沿着RCA的产物形成多重的双链片段，形成的双链片段能够被 Rsal(能够识别和切割双链回文序列5'-GT丨AC-3'，丨代表切割位点）是被并切割，使得 长的RCA产物转化为多个新的D-probe单体。随后，对Rsal进行热失活，同时该过程也起 到了退火的作用，使得碎片P2从新的D-probe单体上解离下来，完整的P2与新的D-probe 单体杂交。值得注意的是，P2偏向于与同一个单体的末端杂交，在T4DNA连接酶的作用下 形成环状的单体产物而不是线性的串联体。再然后，新形成的多个环状的D-probe单体和 P2触发新一轮的滚环扩增，因此实现级联的滚环扩增，产生更多的大量的D-probe复制体。 最后，多分子插入的SybrGreenI与D-probe复制体的莖部结合，产生明显增强的焚光信 号。因此，通过荧光信号的测量能够实现灵敏的、准确的M.SssI甲基转移酶活性的分析。
[0040] 可行性
[0041] 为了研究该M.SssI甲基转移酶活性分析方法的可行性，聚丙烯酰胺电泳实验首 先被用来验证甲基化过程。如图2A，M.SssI甲基转移酶不存在时，电泳条带3中可以观 察到两条迀移速率比较快的亮带，表明未甲基化的D-probe被内切酶切成了两部分。然 而，当M.sssI甲基转移酶和Hpall内切酶都存在时，条带2中仅能观察到一条与原始的 D-probe(条带1)迀移速率相同的亮带，表明甲基化反应的发生以及甲基化的D-probe不能 被Hpall内切酶切断。
[0042] 为了进一步验证甲基化保护的D-probe能够被级联的滚环扩增过程放大，琼脂糖 电泳实验被用来检测放大产物。如图2B，条带a中没有明显的亮带，表明没有明显的RCA过 程的发生，这与D-probe被Hpall内切酶切割成两段不能触发级联的滚环扩增的事实一致。 作为对比，在条带b和c中，分别有明显的具有高分子量的亮带，表明滚环扩增过程的发生。 此外，条带c与条带b相比，亮带更大，更亮，这证实了级联的滚环扩增相比与线性的滚环扩 增能够产生更多的滚环扩增产物。
[0043] 最后，荧光测量被用来监测反应进程和进一步的验证M.SssI甲基转移酶活性分 析方法的可行性。如图2C，仅有D-probe，Pl和P2存在时，体系具有微弱的荧光信号（曲线 a)，而这个微弱的信号的产生可能来源于P1/P2的杂交体。在不含有M.SssI甲基转移酶的 空白体系中，荧光信号几乎不变（曲线b)，这与目标物不存在时，D-probe被Hpall内切酶 切成两部分而不能触发级联的滚环扩增过程的事实相符合。重要的是，几乎没有增强的荧 光信号表明级联的滚环扩增过程能够被有效的阻止并确保一个可忽略不计的非特异性的 放大。当向体系中进一步的加入M. SssI甲基转移酶时，线性的（曲线c)和级联的（曲线d)滚环扩增体系中均能观察到明显的荧光增强，表明甲基化的发生以及随后的甲基化保护 的D-probe介导的线性的和级联的滚环扩增策略的进行。此外，级联的滚环扩增体系与线 性的滚环扩增体系相比具有更明显的荧光信号的增强进一步的证实了级联的滚环扩增更 强的放大能力。这些结果与电泳实验的结果一致，共同证实了该基于目标物保护的D-probe 介导的级联的滚环扩增策略的甲基转移酶活性分析方法是可行的。
[0044] 传感体系的分析性能
[0045] 在最优的实验条件下，我们评估了该M.SssI甲基转移酶活性分析方法的灵敏度 和动力学范围。图3A描述了不同浓度的M.sssl的荧光响应。随着M.SssI甲基转移酶的 浓度从0到100U/mL逐渐增加，荧光强度也逐渐增加。在图3B(内插图），可以观察到荧光 强度与M.SssI浓度（0. 01到50U/mL范围内）的对数有一个良好的线性拟合关系。线性方 程为ΔF= 4389. 9+1674. 71gC，线性相关系数R为0. 995,其中ΔF=F-F。，F和F。分别是 目标物存在和不存在时体系的荧光强度，估算检测限为〇. 〇〇24U/mL，该检出限低于大多数 基于双链DNA或发夹DNA分子探针介导的滚环扩增的方法。同时，对照试验线性的滚环扩 增（一轮滚环扩增）的传感性能也在该文章中进行了评估（图4)。估算的检测限为0. 08U/ mL，比级联的滚环扩增的体系高很多。这些结果再次验证了级联的滚环扩增的强的放大能 力，从而确保了更灵敏的甲基转移酶活性的分析。此外，该方法的日内和日间精密度也分别 在0. 025, 1. 0, 25U/mL三个浓度下进行了考查。在这三个浓度下，日内实验的相对标准偏差 分别为4. 6%，4. 0%，4. 6%，日间实验的相对标准偏差分别为6. 3%，6. 5%，6. 2%。这些 结果表明该甲基转移酶活性分析方法具有良好的重现性。
[0046] 特异性
[0047] 为了考察该方法的选择性，其他的胞嘧啶甲基转移酶，包括Alul，HaellI和 Hhal被选作干扰甲基转移酶。Alul，HaeIII和Hhal分别可以对双链回文序列中的 5' -AGCT-3'，5' -GGCC-3'，5' -GCGC-3'胞嘧啶进行甲基化。如图5,只有当M.SssI甲基 转移酶存在时，才能观察到明显的相对荧光强度，表明该传感方法对M.SssI甲基转移酶 具有良好的选择性。这明显是由于在Hpall的识别序列5'-CCGG3'中的胞嘧啶不能被 Alul，Haelll和Hhal甲基化，而这些未甲基化的D-probe则会被Hpall内切酶裂解。
[0048] 复杂生物样品的分析
[0049] 为了检验该传感体系对细胞内和实际样品甲基转移酶活性分析的可能性，实验过 程中细胞裂解液被加入到缓冲体系中模拟细胞内复杂体系。荧光强度和甲基转移酶浓度的 对数的线性关系与在缓冲体系中的线性关系相似（图6)。此外，我们也对三个不同浓度的 (0.025, 1.0和25U/mL)的回收率进行了计算，分别为92%，91 %和98%。这些结果表明， 该传感体系在细胞内模拟体系中表现良好，有望进一步用于实际样品的分析。
[0050] 抑制剂评估实验
[0051] 由于DNA甲基转移酶活性的调控可能会阻止异常的DNA甲基化或杀死癌细胞，因 此DNA甲基转移酶抑制剂的筛选用于活性抑制已经在疾病诊断中引起了广泛的关注。在本 研究中，我们考察了该方法对M.SssI甲基转移酶抑制剂评估和筛选能力。5-氮杂胞苷和 5-氮杂-2' -脱氧胞苷（5-Aza和5-Aza-dC)两种抗癌药物被选作模型抑制剂。考虑到整 个过程中还涉及Hpall,Rsal，T4DNA连接酶和phi29DNA聚合酶，两种药物（均为5μM)对 这些酶活性的影响。结果表明，影响是可以忽略不计的。因此，我们进一步的评估了这两种 药物（5μΜ内）对M.sssl甲基转移酶的抑制效应。图7表明，M.SssI的活性随着两种药物 浓度的增加而逐渐降低，表明DNA甲基化的削弱。5-Aza和5-Aza-dCIC5。值（降低50%酶 活性所需的抑制剂浓度）分别为3. 0和0. 46μM。由此可见，两种药物的抑制效应具有明显 的剂量依赖性，5-Aza-dC与5-