物对祀核酸进行PCR扩增和生物素标记，其中一 组引物对用于扩增leSrDNA基因，产物通过固相支持物表面固定的核巧酸序列选自SEQID NOs;11~28的寡核巧酸探针来检测，可W鉴定结核、鸟、胞内、偶然、賊肿或堪萨斯分枝杆 菌；另一组引物对用于扩增rpoB基因，产物通过固相支持物表面固定的核巧酸序列选自 沈QIDNOs;29~54的寡核巧酸探针来检测，可W鉴定C531T、C526G、T533C、C526T、A526T、 A526G、A516T或巧11C位点的突变；此外，本发明的试剂盒还有一组阳性对照引物对用于质 控PCR反应体系。由此，本发明的试剂盒可W在鉴定出结核分枝杆菌的同时，检测其对利福 平药物是敏感还是耐药。
[0097] 为了提高本发明的试剂盒中核酸探针检测祀核酸的特异性，本发明的试剂盒专口 为每条用于检测基因突变的核酸探针引入了一个人工错义突变碱基。常规方法检测单个碱 基突变时，为了达到识别单个碱基差异的目的，需要把核酸探针序列缩短为15~16个碱 基，但缺点是核酸探针的杂交信号很弱，而且由于单个碱基的错配仍然容易产生交叉反应。 为了解决送个问题，本发明的试剂盒在用于检测基因突变的核酸探针序列中专口引入一个 人为的错义突变（此位点靠近核酸探针的一端），同时增加核酸探针的长度为18~20个碱 基，从而显著提高了核酸探针的杂交效率。因此，当将本发明的试剂盒用于检测野生型rpoB 基因时，核酸探针序列与祀核酸存在2个碱基的不匹配，就不会杂交，而野生型探针与革己核 酸虽然也有一个碱基不匹配，但送个碱基靠近核酸探针的一端，因此仍然会与祀核酸产生 有效的杂交；而当将本发明的试剂盒用于检测突变型rpoB基因时，野生型探针序列与革己核 酸存在2个碱基的不匹配，就不会杂交，而突变检测探针与祀核酸虽然也有一个碱基不匹 配，但送个碱基也靠近核酸探针的一端，因此仍然会与祀核酸产生有效的杂交。
[0098] 根据本发明的一个具体实施例，所述PCR反应试剂还包括用于增强所述引物对的 PCR扩增效率的加强引物对；其中，
[0099] 所述加强引物对的上游引物序列如SEQIDNO;7所示，5'端生物素标记；
[0100] 所述加强引物对的下游引物序列如SEQIDNO;8所示。
[0101] 在本发明的试剂盒中，所述加强引物对的序列同时也是第一引物组或第二引物组 的序列的一部分，可W用于提高所述两个引物组的PCR扩增效率。
[0102] 根据本发明的一个具体实施例，当将加强引物对与第一引物组一起作为混合引物 使用时，可W增强用于扩增巧oB基因的引物对的PCR扩增的效率。
[0103] 根据本发明的一个具体实施例，当将加强引物对与第二引物组一起作为混合引物 使用时，可W同时增强用于扩增16SrDNA的引物对和用于扩增rpoB基因的引物对的PCR扩 增效率。
[0104] 在本发明的试剂盒中，所述加强引物对的工作原理如下：除了PCR反应体系中加 入加强引物对外，扩增rpoB基因的引物对或/和leSrDNA引物对的5'端也连接了加强引 物的序列。送样，扩增样品开始阶段，巧oB基因或/和leSrDNA的片段被扩增出来，送时送 些片段中就被引入了加强引物序列，于是加强引物对（浓度较高）开始工作，高效率地扩增 巧oB基因或/和leSrDNA的片段，因此，巧oB基因或/和leSrDNA的扩增效率增加明显，显 著提高了rpoB基因突变的检测灵敏度。
[0105] 根据本发明的一个具体实施例，所述PCR反应试剂还包括化qDNA聚合酶、 4xdNTPs(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、缓冲溶液剂、镇离子及其他必要成分。其中，所述缓冲 溶液可W是10~50mmol/L化is-HCl缓冲溶液，镇离子的浓度可W选自1. 5~2. 5mM，优选 浓度是2mM。
[0106] 在本发明的试剂盒中，所述的"核酸探针"是指在含有与祀序列互补的碱基序列核 酸中，固定于固相支持物表面的核酸片段，核酸探针具有与所述祀序列至少一部分互补的 序列，由此，可在适宜的条件下与祀序列进行杂交。
[0107] 在本发明的试剂盒中，所述的"祀核酸"是指具有祀序列的核酸，其可W来自于被 检测者的姨液、血液、支气管洗液、腹水W及脑脊液中结核分枝杆菌基因组核酸样品。
[010引在本发明的试剂盒中，所述的"祀序列"是指在祀核酸中包含的序列，祀序列用于 检测祀核酸。
[0109] 本发明的试剂盒可W使用常规核酸提取方法或市售的核酸提取试剂盒从临床样 品中提取祀核酸。
[0110] 本发明的试剂盒不仅将碱性磯酸酶标记链霉亲和素直接加入到杂交液中，使得核 酸杂交与酶联反应合二为一进行，而且可W将洗膜与显色过程合二为一进行，避免了大量 的洗涂操作步骤和反应溶液，从而把传统反向分子杂交技术变成了一项简易操作的模式， 既为操作人员带来了便利，实验不再容易出错，又节省了大量实验时间和试剂，此外还大幅 度提高了样品中祀核酸的检测通量，能够使得检测结果保持较高的特异性。
【附图说明】
[0111] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图做简单地介绍，显而易见，下面简述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本 领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W根据送些附图获得其他的 附图。
[0112] 图1表示本发明的实施例9的显色结果图。
[0113] 图2表示本发明的实施例10的显色结果图。
[0114] 图3表示本发明的实施例11的显色结果图。
[0115] 图4表示本发明的实施例12的显色结果图。
[0116] 图5表示本发明的实施例13的显色结果图。
[0117] 图6表示本发明的实施例14的显色结果图。
[011引图7表示本发明的实施例15的显色结果图。
[0119] 图8表示本发明的实施例16的显色结果图。
【具体实施方式】
[0120] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可W通过市购获得的常规产品。
[0121] 在W下实施例中，牛血清白蛋白下简称BSA)、阳离子型聚丙帰醜胺下简称 CPAM)、碱性磯酸酶标记链霉亲和素（W下简称SA-AP)、多聚赖氨酸（W下简称化L)、聚己 二醇8000、烷基葡萄糖巧的浓度是Wg/ml计的质量体积百分比浓度；Tween-20和Triton X-100的浓度是指体积百分比浓度。
[0122] W下为结核分枝杆菌及其耐药基因突变的试剂盒的制备实施例
[0123] 实施例1 :
[0124] 主要原料及试剂
[01巧]硝酸纤维素膜；由密理博公司（Millipore)生产，0. 45μm孔径规格；
[0126] 20XSSC缓冲溶液，其配制过程如下；称取88. 2g巧樣酸Η钢（购自上海生工）和 175. 3g化C1溶解于800ml纯水中，充分混匀，用浓肥1调节溶液抑值至7. 0 + 0. 1，补加纯 水至1000ml即可；
[0127] 末端脱氧核巧酸转移酶灯dT) ;5U/μ1，100μ1购自上海江莱生物科技有限公司；
[0128] 10XTdT缓冲液：与TdT酶配套，由上海江莱生物科技有限公司提供；
[0129] dTTP;100mmol/L购自promega公司；
[0130] 用于检测结核分枝杆菌的寡核巧酸探针，其序列如SEQIDNO;11所示；
[0131] 用于检测鸟分枝杆菌的寡核巧酸探针，其序列如SEQIDNO;14所示；
[0132] 用于检测胞内分枝杆菌探针的寡核巧酸探针，其序列如SEQIDNO;17所示；
[0133] 用于检测偶然分枝杆菌的寡核巧酸探针，其序列如SEQIDNO;20所示；
[0134] 用于检测賊肿分枝杆菌的寡核巧酸探针，其序列如SEQIDNO;23所示；
[0135] 用于检测堪萨斯分枝杆菌的寡核巧酸探针，其序列如SEQIDNO;26所示；
[0136] 用于检测巧33C野生型的寡核巧酸探针，其序列如SEQIDNO;29所示；
[0137] 用于检测巧33C突变的寡核巧酸探针，其序列如SEQIDNO;31所示；
[0138] 用于检测巧31T野生型的寡核巧酸探针，其序列如SEQIDNO;33所示；
[0139] 用于检测巧31T突变的寡核巧酸探针，其序列如SEQIDNO;35所示；
[0140] 用于检测526野生型的寡核巧酸探针，其序列如SEQIDNO;37所示；
[0141] 用于检测巧26G突变探针的寡核巧酸探针，其序列如SEQIDNO;39所示；
[0142] 用于检测巧26T突变的寡核巧酸探针，其序列如SEQIDNO;41所示；
[0143] 用于检测A526T突变探针的寡核巧酸探针，其序列如SEQIDNO;43所示；
[0144] 用于检测A526G突变的寡核巧酸探针，其序列如SEQIDNO;45所示；
[0145] 用于检测A516T野生型探针的寡核巧酸探针，其序列如SEQIDNO;47所示；
[0146] 用于检测A516T突变的寡核巧酸探针，其序列如SEQIDNO;49所示；
[0147] 用于检测巧11C野生型探针的寡核巧酸探针，其序列如SEQIDNO;51所示；
[0148] 用于检测巧11C突变的寡核巧酸探针，其序列如SEQIDNO;53所示。
[0149] 阳性对照探针，其序列如SEQIDNO;55所示；
[0150] 阴性对照探针，其序列如SEQIDNO;57所示；
[0151] GoTaq酶；5U/μ1，购自promega公司；
[0152] 10XTaq酶反应缓冲溶液；购自promega公司；
[015引MgClz:25mM,购自promega公司；
[0154] dNTPsMix 购自promega公司；
[0155] 碱性磯酸酶标记链霉亲和素购自Gibcol公司；
[0156] 氯化锋：购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
[0157] 牛血清白蛋白度SA);购自Sigma-Al化ich;
[0158] Tween-20 ;购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
[0159] 多聚赖氨酸；购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
[0160] 聚己二醇8000、正十二烷基葡萄糖巧、硝基藍四氮哇（W下简称NBT)和 5-漠-4-氯-3-剛巧基-磯酸（W下简称BCI巧均直接购自生工生物工程（上海）股份有 限公司。
[0161] (一）固相支持物的制备
[0162] 1. 1固相支持物的处理；将硝酸纤维素膜裁成2cmX1cm，用綴子取硝酸纤维素膜 放置在15XSSC中浸泡15min,取出后置于滤纸上，60°C烘干1. 5小时。
[0163] 1. 2核酸探针溶液配制；对6种用于检测分枝杆菌的探针、13种用于检测rpoB基 因突变的探针W及阳性对照探针和阴性对照探针，用灭菌纯水分别溶解上述21种探针的 干粉，配制成浓度为100μΜ的探针溶液。
[0164] 1. 3核酸探针加尾；对每种核酸探针溶液（100μΜ，即l(K)pmol/u1)，取2μ1即 20化mol的核酸探针量加入到100μ1含有60UTdT酶、1XTdT反应缓冲液和lOOnmol/L的 dTTP溶液中，37°