封装，或其它合适容器）。任选，使用说明书另外提供于这种试剂盒 中。
[0145] 如本文所描述，本发明提供了测定（R)-N-甲基纳曲酮溴化物的样品纯度的方法。 在某些实施方案中，这种方法可以使用参考标准。本文使用的术语"参考标准"是指药物物 质、赋形剂、杂质、降解产物、营养增补剂、药典试剂（compendial reagents)和性能校正品 的高度表征的样品。需要将它们用于进行美国药典所定义的正式的USP-NF测试和试验。正 如本领域普通技术人员所理解的那样，USP参考标准还用作校正品（例如，颗粒统计、熔点、 和滴定标准和作为空白和对照物）。参考标准主要用于色谱和分光光度法。在某些实施方 案中，本发明提供了化合物II-1作为参考标准。在一些实施方案中，本发明提供了试剂盒， 其包含：化合物Π -1参考标准和任选下列的一个或多个参考标准：(R)-N-甲基纳曲酮溴化 物、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质Η和杂质I，如下面实施例1所详述。
[0146] 为了可以更充分地理解本文描述的发明，列出下列实施例。应该理解，这些实施例 仅仅用于说明性目的，不应该将其理解为以任何方式限制本发明。
[0147] 经过必要的变更，本发明每个方面的所有特征适用于所有其它方面。 实施例
[0148] 一般方法 化合物II1-1可以例如按照国际专利申请公开W02006/127899所详细描述的方法来制 备，本文结合其全部内容作为参考。
[0149] 使用 Agilent 1100 HPLC系统（与 Applied Biosystems-PE SCIEX QSTAR PULSAR i四极飞行时间型串联质谱仪连接，配备电喷射离子化离子源，在阳离子化模式下操作）进 行质谱分析。使HPLC洗脱液分裂（split)以大约50 μ L/min的流速进入到质谱仪的离子 源中。
[0150] 在DMS0-d6中进行化合物II-1的NMR谱分析，在配备三共振反向检测（TXI)探头 的Bruker DRX 500 NMR谱仪上获得谱。TMS用作质子共振（δ 在0. 00处）的内标，溶剂 DMS0-d6用作碳共振（δ 13C，在39. 5处）的内标。
[0151] 本文使用下列缩写，并且具有下列含义： 缩写索引
[0152] 实施例1 RRT 0.60的分离和特征鉴定 在20 mg/mL等渗盐水溶液中，用HPLC分析预先鉴定甲基纳曲酮（化合物III-1) 的至少三个降解产物（当通过HPLC分析产物时，确定为在大约0.72、0. 89和1.48处 的RRT峰）。参见，例如，美国专利申请公开20040266806 (2004年12月30日公开）和 TO2008/019115(2008年2月14日公开）。近来，检验了包含甲基纳曲酮的预装填注射器的 降解物的生成。观察到一种新的降解产物，具有大约0.60的RRT。图1描述了这种预装填 注射器的稳定性研究的LC/MS结果，在40°C和75%相对湿度下，经过6个月之后。
[0153] 对于 HPLC 分析，使用 Prodigy 0DS-3 15cm X 2. 0mm，3 μ m颗粒（Phenomenex) HPLC 柱，流速0. 25 mL/min，使用下列洗脱液： 流动相：强度（等度（isocratic) : 75:25(v/v)0. 1% TFA在水/甲醇中 纯度：（梯度）： 流动相A=95:5 (v/v) 0. 1% TFA在水/甲醇中 流动相Β=35:65 (v/v) 0. 1% TFB在水/甲醇中 梯度方案：
柱温：50°C 流速：0. 25 mL/分钟 检测：UV，280 nm 或 310 nm 注射体积：20 μ L 样品溶剂：〇. 05M磷酸二钠，pH6. 8。
[0154] 用相关计算的相对保留时间（"RRT"）和相对响应因子（"RRF"）鉴定化合物和 已知杂质的下列标准：
[0155] 确定杂质B(RRT 0. 79,称为"环缩合"的降解物）为（R)-N-甲基纳曲酮溴化物的 环缩合形式，并且具有下列结构：
[0156] 确定杂质C(本文也指为化合物IV-1，RRT 0.89降解物，称为"醌降解物"）为 (R)-N-甲基纳曲酮溴化物的光降解产物，并且具有下列结构：
[0157] 在某些实施方案中，本发明提供了组合物，其包含下列中的一种或多种：杂质A， 杂质B，杂质C，杂质D，杂质E，杂质F，杂质G，杂质Η和杂质I。在一些实施方案中，本发明 提供了试剂盒，其包括管瓶，管瓶包含下列中的每一种：(R)-N-甲基纳曲酮溴化物、杂质Α、 杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质Η和杂质I。在某些方面中，本发明提供 了试剂盒，其包含下列中的每一种：(R)-N_甲基纳曲酮溴化物、杂质Α、杂质Β、杂质C、杂质 D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质Η和杂质I，其中每种杂质化合物包含在单独的管瓶内。
[0158] 将杂质A(RRT 0. 60化合物，指的是上面"二醇降解物"）分离、表征，其相当于化 合物Π -1。具体地说，在（R)-N-甲基纳曲酮预装填的注射器稳定性样品中，对在RRT 0.60 处洗脱出的未知蜂进行LC/MS。图2描绘了总离子色谱（TIC)、UV色谱（λ =280 nm)、RRT 0. 60峰所得到的质谱和UV光谱。UV光谱在大约310 nm处具有独特的吸收，这与预先鉴定 的醌化合物相似，其具有大约0. 89的RRT。
[0159] 测定的精确质量372. 1809 amu相当于C21H26N05+的元素组成（误差：0. 4 mDa)。 它的分子式表示该未知蜂包含的氧原子比上述醌化合物多一个。
[0160] 实施例2 化合物Π -1和II-3的合成制备:
[0161] 方法 A 将化合物m-1的溶液溶解在1M TRIS(pH8)缓冲液中，并以1:1.2的摩尔比加入 H202 (30%)。在HPLC注射之前，通过加入TFA来终止反应，溶液从褐色/红色变为黄色。将该 溶液注射到制备HPLC (带有Sunfire柱（50x250 mm，C18,5Mm)，流速100 mL/min，流动相起 始于6% MeOH/O. 25%TFA，1 min，而后转变为 12% MeOH/O. 25%TFA 的梯度，用 30 min)中。将收 集的馏份用两份水稀释，并将化合物吸附到反相聚合吸附剂（Strata-X，获自Phenomenex) 上。将该柱置于真空条件下，除去所有残余的液体，并使用乙腈来洗脱化合物。
[0162] 将大约20%水加入到洗脱液中，然后使其通过强阴离子交换柱（装有溴化物） (Strata-SAX，获自Phenomenex)。通过用二氯甲烧提取，从洗脱液中除去乙腈。将水层的 pH值调节至4. 2 (避免水解的最佳酸度），而后冷冻干燥，获得红色粉末。通过将红色粉末 溶解在水中，并将溶液放入到水浴（70°C)中，使晶体立即形成而将化合物结晶。过滤晶体， 真空干燥，提供化合物II-1红色晶体。所得到的晶体化合物II-1的X射线衍射图描绘于 图12中。所得到的晶体化合物II-1的质谱描绘于图13中。所得到的晶体化合物II-1的 虫NMR描绘于图14中。
[0163] 方法 B 将化合物m-ι的溶液溶解在1M TRIS(pH8)缓冲液中，并以1:2的摩尔比加入 H202 (30%)。在室温下保持大约30分钟之后，通过加入TFA来终止反应，溶液从褐色/红色 变为黄色。将该溶液注射到制备HPLC(带有Sunfire柱（50x250 mm，C18,5Mm)，流速100 mL/min，流动相起始于 6% MeOH/O. 25%TFA，1 min，而后转变为 12% MeOH/O. 25%TFA 的梯度， 用30 min)中。将收集的馏份立即冷冻，并冻干，得到化合物II-3黄色固体。
[0164] 化合物III-1与H202反应形成化合物II-3是在不同的pH值条件下进行的，以便 测定pH值对反应的影响。据发现，在酸性pH值下，化合物II1-1与H202的反应很慢，而在 碱性pH值下，随着pH值的升高，反应更快（参见图3)。
[0165] 使用下列测定化合物II-3的结构说明：UV光谱；ESI-MS ;MS/MS NMR，13C NMR 和二维NMR技术，如下面所详述。下面描绘了位置编号。
[0166] NMR结果 使用C0SY、HSQC、HMBC和R0ESY光谱，对1Η和13C NMR共振进行分配。所述分配列在下 面表1中。
[0167] 表1.在DMSO-df^，化合物II-1的1Η和13C共振分配
a 位移相对于 DMS0-d6 ( δ 13C=39. 5)。b位移相对于TMS ( δ 4=0. 0)。
[0168] COSY光谱（图6)表明，除了 Η-5之外，所有的1Η-1!!自旋（spin)系统与醌化合物 (杂质D)所观察到的那些自旋系统相同。在醌化合物（杂质D)中，C-5是亚甲基碳，具有两 个充分拆分的非对映异构的质子，在化合物Π -1中，H-5是次甲基质子（在δ 5. 08处）。 HSQC光谱（图7)证实了 C-5次甲基的存在，其表明Η-5与δ 74. 8(与氧连接的碳的典型的 化学位移）处的碳相连接。
[0169] 在1H NMR谱（图8)中，在δ 12. 21和8. 58处观察到两个羟基质子，分别分配于 C-4和C-5 0Η基团。它们的低磁场化学位移和宽峰形状表明它们彼此很接近，表示C-5羟 基在α方向上，如下面所描绘。
[0170] HMBC光谱（图9)提供了额外的证据：C-5的羟基面向下面。Η-5显示了与C-12的 强的三键相互关系，要求它们具有如下面所描绘的反式共面关系：
[0171] R0ESY光谱证实了 Η-5的轴向（图10)。Η-5显示了 NOEs的1，3-diaxal类型， C-14-OH 在 δ 6. 82 处，H-8 在 δ 2. 70 处，和 H-14 在 δ 2. 50 处。化合物 II-3 的 13C NMR 谱 示于图11中。
[0172] 实施例3 合成的化合物II-3和分离的RRT 0.60的比较 利用LC-MS分析按照实施例2方法B制备的化合物11-3。如图2所描绘，大约9分钟 时洗脱的主尖锋与RRT 0. 60峰具有相同的质谱和UV光谱。此外，测定的精确质量372. 1785 amu提供了相同的离子式（误差：-2.0 mDa)。另外，按照实施例2方法B制备的化合物 II-3的尖峰进入到从实施例1描述的稳定性研究中所得到样品的尖峰中。图4显示了非 尖峰和尖峰样品两者的UV色谱。RRT 0. 60的峰明显地表示合成的化合物II-3是相同的 化合物。对m/z 372的离子进行LC-MS/MS，获得结构信息。RRT 0.60峰和合成样品的MS/ MS数据示于图4的下部两个方框中。两个光谱相当类似，不过，合成化合物提供了更好得 多的碎片离子强度。具有基于NMR数据的化学结构的片段分配示于图5中。LC/MS数据与 NMR实验所测定的结构一致。
[0173] 实施例4 氧化方法的评价:
如上面实施例2所述，通过用H202氧化化合物III-1来制备化合物11-1。进行额外氧 化剂的筛选，以便使氧化反应的产率和纯度最佳化。进行该反应的概述列在下面表A至E 中。本文使用的术语"SLI"是指单一最大杂质。
[0174] 正如下面表A所概括的那样，反应在室温下进行，使用1当量的各种氧化剂。
[0175] 对于每个反应，将0. 5 g III-1与6 mL TRIS. HC1(1M，pH8. 0,在水中）混合。加 入氧化剂（1当量），并将得到的混合物在室温下搅拌指定的时间。利用HPLC(280 nM)监控 所有的反应。％数值按照色谱数值报道。
[0176] 表 A.
[0177] 如下面表B所概述，用变化当量的氧化试剂（即，氧化剂）和变化的反应时间进行 氧化反应。
[0178] 对于每个反应，将0. 5 g III-1与6 mL TRIS. HCl(lM，pH8. 0,在水中）混合，并冷 却至~10°C。加入氧化剂（规定量），并在室温下将得到的混合物搅拌指定的时间。
[0179] 表 B.
[0180] 如下面表C所概述，用变化当量的H202和tBHP进行氧化反应，并在室温下延长搅 拌时间。
[0181] 对于每个反应，将0. 5 g III-1与6 mL TRIS. HC1(1M，pH8. 0,在水中）混合。加 入氧化剂，并将得到的混合物搅拌指定的时间。
[0182] 表 C.
[0183] 如下面表D所概述，用变化当量的tBHP进行氧化反应，并在高温（35°C )下延长搅 拌时间。
[0184] 对于每个反应，将0. 5 g III-1与6 mL TRIS. HC1(1M，pH8. 0,在水中）混合。加 入指定数量的氧化剂，并在35°C将反应搅拌指定的时间。
[0185] 表 D.
[0186] 如下面表E所概述，在变化的溶剂中，用tBHP进行氧化反应。
[0187] 对于每个反应，将0. 5 g III-1与3 mL TRIS. HC1缓冲液（1Μ，ρΗ8. 0)和指定的溶 剂（3 mL)混合。加入70% TBHP (5当量），并将得到的混合物在室温下搅拌48小时。
[0188] 表 E.
[0189] 实施例5 鹤酸盐稳定性研究 进行短期评价，以便研究钨酸盐对甲基纳曲酮溴化物在高温和氧气接触的应力条件下 形成RRT 0.60的影响。对于该应力样品，用1 mM钨酸钠掺入制剂，并在室温下吹入氧气一 小时。然后将溶液在121°C进行热压处理一小时。还制备对照样品，在这些样品中，在不接 触钨酸盐、氧气或加热的条件下制备每个溶液。
[0190] 在经过上述应力条件之后，使样品接触钨、氧气和热量，产生28 ppm的RRT 0.60 降解物。在对照样品中观察到更低水平的这种降解物。基于该研究，钨可以帮助催化形成 RRT 0.60降解物。在对照样品中观察到的RRT 0.60降解物的水平表明，在这种氧化降解反 应中，温度和氧含量也是影响因素。
[0191] 进行18个月的长期评价，以便研究钨酸盐对甲基纳曲酮溴化物在标准条件下、在 标准无菌、清洁、备用于装填的（SCF?)注射器（1 mL Becton Dickinson(BD)注射器，1型硼 硅玻璃，带有27G X %英寸的不锈钢针头，BD塞11510, West 4023/50灰色溴化丁基橡胶。 涂层：接触面用Daikyo Fluro Tec，其余部分用B2-40涂层，BD刚性针头屏蔽带有FM27/0 橡胶针头屏蔽和聚丙烯刚性屏蔽罩）中形成RRT 0.60的影响。在该研究中，将包含8 mg 甲基纳曲酮单元剂量（8 mg甲基纳曲酮在0.4 mL水中，水中含有2. 6 mg氯化钠、0.16 mg 依地酸f丐二钠和0· 12 mg甘氨酸盐酸盐）或12 mg甲基纳曲酮单元剂量（12 mg甲基纳曲 酮在0. 6mL水中，水中含有3. 9 mg氯化钠、0. 24 mg依地酸钙二钠和0. 18 mg甘氨酸盐酸 盐）的注射器保存在下列条件下：25°(：/60%冊、30°(：/75%冊和40°(：/75%冊。该研究的结 果表明，在25°C和60% RH条件下，形成的RRT 0. 60化合物的水平达到40 ppm，在30°C和 75% RH条件下，高达204 ppm。在40°C和75% RH条件下经过6个月之后，观察到145 ppm。 这些结果示于下面表2中。
[0192] 表2. RRT 0. 60在标准SCF注射器中的数量（ppm) '
[0193] 进行另一个稳定性研究，以便研究甲基纳曲酮溴化物在"超低"钨注射器（Becton DiCkenS〇n)(l mL BD注射器，1型硼硅玻璃，带有29G X %英寸的不锈钢针头（超低钨）， BD塞11510, West 4023/50灰色溴化丁基橡胶。涂层：接触面用Daikyo Fluro Tec，其余 部分用B2-40涂层，BD刚性针头屏蔽带有热塑性弹性体（TPE)针头屏蔽和聚丙烯刚性屏蔽 罩）中保存对形成RRT 0.60的影响。该研究的结果表明，在40°C和75%相对湿度条件下经 过6个月之后，或在25 °C和60%相对湿度条件下经过9个月之后，形成的RRT 0. 60化合物 不超过25 ppm或更高的水平。这些结果示于下面表3中。
[0194] 表3. RRT 0.60在超低钨注射器中的数量（ppm) *_
*所有的数值以ppm报道，利用310 nm HPLC方法获得 L0Q=7 ppm NA=不适用。
[0195] 实施例6 化合物ιι-ι多晶型物的X射线衍射研宄 按照实施例2方法A制备的化合物II-1多晶型物的粉末XRD分析是在X' PERT-Mro粉 末X射线衍射仪上进行的。
[0196] 将样品研磨成细粉末，并装入带有零背景板的腔式样品座中。以角位置（2 Θ )的 粉末X射线衍射为特征的峰位置描绘在图15中。在某些实施方案中，本发明提供了化合 物II-1的结晶形式，其特征在于：所述形式具有基本上与图15所描绘的粉末X射线衍射图 相似的粉末X射线衍射图。
[0197] 实施例7 HPLC方法 如本文所描述，甲基纳曲酮溴化物的潜在杂质的检测和定量是药物质量和纯度的重要 的、并且是法规控制的方面。本发明的另一个方面提供了在法规控制标准所要求的水平下 用于检测杂质A(本文还指的是RRT 0.60降解物、杂质或化合物以及也指化合物II-1)的 分析方法。在某些实施方案中，该分析方法能够检测N-甲基纳曲酮溴化物样品中大约2. 5 ppm水平的杂质A。在一些