的L-丙氨酰-L-谷氨 酰胺、浓度为约〇. 5mM的L-精氨酸盐酸盐、浓度为约0. 05mM的L-天冬酰胺-H20、浓度为 约0. 15mM的L-半胱氨酸盐酸盐-H20、浓度为约0. 2mM的L-组氨酸盐酸盐-H20、浓度为约 0. 8mM的L-异亮氨酸、浓度为约0. 8mM的L-亮氨酸、浓度为约0. 8mM的L-赖氨酸盐酸盐、 浓度为约〇. 2mM的L-甲硫氨酸、浓度为约0. 4mM的L-苯丙氨酸、浓度为约0.1 mM的L-脯氨 酸、浓度为约〇. 7mM的L-苏氨酸、浓度为约0. 07mM的L-色氨酸、浓度为约0. 4mM的L-酪 氨酸二钠盐二水合物、浓度为约0. 7mM的L-缬氨酸，及它们的组合。
[0094] 在某些实施方式中，培养基不包含L-胱氨酸2HC1。
[0095] 促讲牛长/维持的维牛素
[0096] 在某些实施方式中，培养基包含一种或多种维生素。在某些实施方式中，一种或多 种维生素选自氯化胆碱、D-泛酸钙（B5)、叶酸（B9)、i-肌醇、烟酰胺（B3)、盐酸吡哆醇、盐 酸硫胺素、维生素 B12(氰钴胺素）、核黄素（B2)及其组合。在某些实施方式中，各维生素以 约0. 00001~约ImM、或约0. 00005~约0. 5mM、或约0. 0001~约0. 9mM、或约0. 0005~约 0. 8mM、或约0. 001~约0. 7mM、或约0. 005~约0. 6mM、或约0. 01~约0. 5mM、或约0. 05~ 约0.1 mM的浓度存在。
[0097] 在某些实施方式中，一种或多种维生素选自浓度为约0. 07mM的氯化胆碱、浓度为 约0. 006mM的D-泛酸钙（B5)、浓度为约0. 006mM的叶酸（B9)、浓度为约0. 07mM的i-肌醇、 浓度为约〇. 〇2mM的烟酰胺（B3)、浓度为约0.0 lOmM的盐酸吡哆醇、浓度为约0. 007mM的盐 酸硫胺素、浓度为约〇. 〇〇〇6mM的维生素 B12 (氰钴胺素）、浓度为约0. 0006mM的核黄素（B2) 及其组合。
[0098] 补充剂
[0099] 在某些实施方式中，培养基还包含一种或多种选自蛋白质（例如，层粘连蛋白、 BSA、脂肪酸游离部分V、过氧化氢酶、胰岛素、人重组胰岛素、胰岛素重组全链、转铁蛋白、人 转铁蛋白、人转铁蛋白（Holo)、超氧化物歧化酶）、神经营养因子（例如，人脑源性神经营养 因子（BDNF)、胶质细胞源神经营养因子（GDNF)、激素、类固醇（例如，皮质酮、孕酮）、甲状 腺激素（例如，T3(三碘-甲状腺原氨酸））、脂肪酸、必需脂肪酸（例如，亚油酸、亚麻酸）、 脂质（例如，胆固醇）、维生素（例如，抗坏血酸（Vit C)、生物素（B7)、DLa生育酚醋酸酯、 DLa生育酚、维生素 A(视黄酸））、硫酸盐矿物（例如，亚硒酸盐）、有机化合物（例如，腐胺 2HC1)、单糖（例如，D-半乳糖）、核苷（例如，二丁酰cAMP钠盐），及它们的组合。
[0100] 在某些实施方式中，各个补充剂以约0. 01~约50 μ g/mL、或约1~约40 μ g/mL、 或约5~约30 μ g/mL、或约10~约20 μ g/mL的浓度存在于培养基中。
[0101] 在某些实施方式中，各个补充剂以约0. 01~约50mg/mL、或约1~约40mg/mL、或 约5~约30mg/mL、或约10~约20mg/mL的浓度存在于培养基中。
[0102] 在其他实施方式中，各个补充剂以约0.000001~约ImM、或约0.00001~约 0. 5mM、或约0. 0001~约0.1 mM、或约0. 001~约0.0 lmM的浓度存在于培养基中。
[0103] 其他培养基配方
[0104] 在某些实施方式中，培养基包含浓度低于约0. 05mM的L-丙氨酸、浓度低于约 0. 25mM的甘氨酸、浓度低于约0. 25mM的L-丝氨酸、浓度低于约0. 15mM的L-脯氨酸、浓度 低于约0. 60mM的L-精氨酸盐酸盐、浓度低于约2. 5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、浓度高于 约0. 41mM的硫酸镁、浓度高于约1. 05mM的氯化f丐、浓度高于约4. 16mM的氯化钾、浓度高于 约120. 7mM的氯化钠、浓度低于约17. 5mM的D-葡萄糖或浓度为约5mM的HEPES。在一些实 施方式中，培养基不包含L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-胱氨酸2HC1、CuS04-5H20、FeS0 4-7H20、 无水氯化镁、亚油酸、腐胺2HC1、硫辛酸、胸苷、次黄嘌呤Na或生物素。
[0105] 在一些实施方式中，L-丙氨酸以约0.0 OlmM~约0. 05mM存在。在其他实施方式 中，L-丙氨酸以约0. 002mM存在。在一些实施方式中，甘氨酸以约0.0 OlmM~约0. 005mM 存在。在其他实施方式中，甘氨酸以约0.002mM存在。在一些实施方式中，L-丝氨酸以约 0.0 OlmM~约0. 005mM存在。在一些实施方式中，L-丝氨酸以约0. 002mM存在。在其他实施 方式中，L-脯氨酸以约0.0 lmM~约0.1 mM存在。在一些实施方式中，L-脯氨酸以约0. 06mM 存在。在其他实施方式中，L-精氨酸盐酸盐以约O.OlmM~约0.5mM存在。在一些实施方 式中，L-精氨酸盐酸盐以约0. 3mM存在。在一些实施方式中，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺以约 0.1 mM~约ImM存在。在其他实施方式中，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺以约0. 5mM存在。
[0106] 在一些实施方式中，硫酸镁以约0.5mM~约5mM存在。在其他实施方式中，硫酸镁 以约ImM存在。在一些实施方式中，氯化钙以约1. ImM~约2mM存在。在一些实施方式中， 氯化钙以约1. ImM存在。在其他实施方式中，氯化钾以约4. 18mM~约4. 5mM存在。在一些 实施方式中，氯化钾以约4. 2mM存在。在一些实施方式中，氯化钠以约121mM~约125mM存 在。在其他实施方式中，氯化钠以约121mM存在。在一些实施方式中，D-葡萄糖以约ImM~ 约10mM存在。在其他实施方式中，D-葡萄糖以约2. 5mM存在。
[0107] 在一些实施方式中，培养基包含浓度为约0. 002mM的L-丙氨酸、浓度为约0. 002mM 的甘氨酸、浓度为约〇. 〇〇2mM的L-丝氨酸、浓度为约0. 06mM的L-脯氨酸、浓度为约0. 3mM 的L-精氨酸盐酸盐以及浓度为约0. 5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
[0108] 在一些实施方式中，培养基包含浓度为约ImM的硫酸镁、浓度为约1. ImM的氯化 钙、浓度为约4. 2mM的氯化钾以及浓度为约121mM的氯化钠。
[0109] 在一些实施方式中，培养基包含浓度低于约0. 05mM的L-丙氨酸、浓度低于约 0. 25mM的甘氨酸、浓度低于约0. 25mM的L-丝氨酸、浓度低于约0. 15mM的L-脯氨酸、浓度 低于约0. 60mM的L-精氨酸盐酸盐、浓度低于约2. 5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、浓度高 于约0. 41mM的硫酸镁、浓度高于约1. 05mM的氯化f丐、浓度高于约4. 16mM的氯化钾、浓度高 于约120. 7mM的氯化钠、浓度低于约17. 5mM的D-葡萄糖以及浓度为约5mM的HEPES。
[0110] 摩尔滲诱压浓度
[0111] 在一些实施方式中，培养基具有低于约315m0smol/L的摩尔渗透压浓度。在其他 实施方式中，摩尔渗透压浓度为约200~约400m0smol/L、或约220~约380m0smol/L、或约 240 ~约 360m0smol/L、或约 260 ~约 340m0smol/L、或约 280 ~约 330m0smol/L、或约 300 ~ 约320m0smol/L。在某些实施方式中，摩尔渗透压浓度为约300m0smol/L~约310m0smol/ L。在一些实施方式中，摩尔渗透压浓度为约310m0smol/L。
[0112] III.培养方法和细朐组合物
[0113] 在另一方面，提供培养神经元细胞的方法。该方法包括，使神经元细胞与本文（包 括其实施方式）提供的培养基接触，并使得神经元细胞生长，从而培养神经元细胞。在一些 实施方式中，神经元细胞是原代神经元细胞。在其他实施方式中，神经元细胞为iPSC来源 的神经元细胞。
[0114] 在另一方面，提供在本文（包括其实施方式）所提供的培养基中培养的哺乳动物 细胞。在一些实施方式中，哺乳动物细胞为神经元细胞。
[0115] 在某些实施方式中，培养基包含一种或多种对能量源例如光和/或电敏感的成 分。在某些实施方式中，使成分与能量例如光或电接触会引起培养基中所培养的细胞例 如神经细胞的活性增加。在某些实施方式中，对培养基持续施以能量可以在培养基中培 养的细胞中产生兴奋毒性作用。在某些实施方式中，对能量敏感的成分选自核黄素（B2)、 HEPES及其组合。在某些实施方式中，作用剂以约〇.〇〇〇〇〇〇 1~约ImM、或约〇.〇〇〇〇〇〇5~约 0· 5mM、或约 0· 000001 ~约 0· 05mM、或约 0· 000005 ~约 0· OlmM、或约 0· 00001 ~约 0· 005mM、 或约0. 00005~约0.0 OlmM、或约0. 0001~约0. 0006mM的浓度存在。在某些实施方式中， 作用剂以低于约〇. 〇〇〇〇6mM的浓度存在。在某些实施方式中，作用剂以约0. 01~约50mM、 或约0. 05~约25mM、或约0. 1~约20mM、或约0. 5~约15mM、或约1~约10mM、或约2~ 约8mM的浓度存在。在某些实施方式中，作用剂以低于约10mM的浓度存在。
[0116] IV.实施例
[0117] I持人脑细朐在体外的突触活件和功能的神经牛理学培养基
[0118] 概要
[0119] 诱导多能干细胞（iPSC)技术使得可以触及患者来源的存活的人神经元，并提供 对神经学和精神疾病进行体外建模的新的可选方法。神经环路的有效模型需要保持神经元 功能的生理条件。因而，申请人具体地检验了在当前用于培养神经元的不同培养基中的神 经元活性。来自啮齿目和人类的神经元常规地在具有多种补充物的基础培养基中体外生 长。已发现，标准的基础培养基（例如，DMEM、Neurobasal)和血清强烈地破坏基本的神经 元功能，包括动作电位放电和突触通讯。为克服这些限制并更好地在体外复制人脑的生理 条件，设计出新的基础培养基（BrainPhys)，其与化学上成分明确的补充物结合，并对其在 多种人神经元培养物上进行彻底测试。该新培养基最优地支持通常在体内观察到的电生理 活性的类型，但除此之外还保持体外长期存活。BrainPhys基本上设计成培养患者或健康受 试者来源的功能性成熟人神经元，但也可以用于啮齿目神经元。总而言之，其提供更加逼真 的功能性体外条件，以对人类神经学疾病进行建模。
[0120] 本实施例描述以下：
[0121] 〇经典基础培养基（DMEM和Neurobasal)和血清强烈地破坏人神经元在体外的基 本功能（动作电位和兴奋性/抑制性突触活性）
[0122] 〇不加血清的BrainPhys基培养基支持最佳的神经元功能（动作电位/突触通 讯）并还保持体外的神经元成熟和脑细胞成活
[0123] 〇BrainPhys基培养基使得具有有效功能突触联系的成熟神经元的比例增加
[0124] 〇含有无血清补充物的BrainPhys可以在数周中保持稳定和健康的神经元活性 并减少在DMEM基培养基中观察到的与饲喂循环相关的波动
[0125] 〇BrainPhys组合物更好地模拟CSF神经生理条件并对人神经和精神疾病的体外 模型提供更逼真的条件，以增加转译成功的机会。
[0126] 结果
[0127] 为评测培养中神经元的神经网络活性，使用得自iPSC或胚胎干细胞（ESC)的人神 经祖细胞（NPC)。使人NPC在具有补充有N2、B27、BDNF、⑶NF、抗坏血酸、cAMP和层粘连蛋 白的多种基础培养基的玻璃盖玻片上经2~8周而分化为神经元。在灌注室中将神经元转 移至盖玻片，以急性地检测细胞在多种胞外溶液中的自发钙活性或电生理特性。
[0128] DMEM/F12基培养基破坏人神经元中的钙活件、自发动作电位放电和突触活件
[0129] 首先对DMEM基培养基中人神经元的钙活性成像，它们在该培养基中培养了数周。 几乎没有找到有活性的人神经元，但是当相同视野在ACSF中成像时，更多的细胞变得自发 有活性。ACSF溶液的组成在实验室间可能微有不同，例如，钙浓度经常高于生理水平从而人 为地增加突触释放，这可能潜在地增加网络活动。为弄清该问题，将我们的ACSF的无机盐 浓度、pH和摩尔渗透压浓度与DMEM中的那些匹配，并重复那些钙成像实验。尽管有那些预 防措施，已证实DMEM中的活性细胞的数量显著低于ACSF (图la)。
[0130] 之后使用膜片钳方法来确定DMEM如何降低人神经元在体外的总体自发活性。已 发现，DMEM总是使神经元的静息电位去极化（η = 22/22细胞，23 ±3mV)。之后检测在ACSF 中的自发活性神经元，并且发现，在罕有的情况下，由DMEM诱导的去极化使放电频率增加 而不会饱和（η = 2/14,图9a)，但是在大多数情况下，其使细胞的放电饱和并沉默（η = 12/14,图 lb、图 9b)。
[0131] 为调查DMEM对突触功能的影响，在Cl-(-70mV)或Na+(0mV)的逆转电位进行电压 钳实验，并发现，可以在ACSF中记录到的自发AMPA和GABA突触反应在DMEM中完全消失 (图lb)。该效果是可逆的，并在每个被测试神经元中发生（η = 6/6细胞）。
[0132] 同时，也观察到，DMEM的灌注一致地引起较大去极化Na+和C1-流进入细胞（例 如，图10)。因而，怀疑存在于DMEM而非ACSF中的组分可以活化神经元上的Na+和C1-通 道。因而，除去DMEM的所有维生素、所有氨基酸或所有额外组分，并且发现，通过除去大量 氨基酸，可以避免DMEM中造成动作电位和突触活性破坏的由DMEM诱导的去极化。然而，该 溶液无法在多于一周的时间内保持神经元的发育和存活（图11)。从这些实验清楚的是， DMEM中的神经活性氨基酸破坏基本神经元功能，包括动作电位传播和突触通讯。
[0133] Neurobasal基培养基减少突角虫通讯和云力作电位放电
[0134] 早先已对DMEM进行改良，以使大鼠原代神经元在培养中的存活最佳[Brewer等 人，1993]。在该改良的称为Neurobasal培养基的版本中，开发者基本上除去了一些兴奋 性氨基酸和硫酸亚铁，并降低摩尔渗透压浓度；他们发现，Neurobasal与DMEM相比改善大 鼠神经元的体外存活[Brewer等人，1993]。尽管细胞存活是细胞培养的关键参数，但未在 Neurobasal中测试基础的电生理特性。因而，将得自人iPSC和ESC的神经元（在神经成熟 培养基中2~8周）用于检视Neurobasal对神经元功能的作用。不像DMEM，Neurobasal并 不使静息膜电位去极化，并偶尔地可以观察到至少一些兴奋性突触反应。然而，Neurobasal 强烈地减少或消除在ACSF中观察到的自发兴奋性突触活性（η = 5/5成熟神经元，ACSF 对照：21· 3±12· 5Hz，Neurobasal-A :0· 44±0· 17Hz，ACSF 恢复：15· 1±10· 5Hz ;图 lc) 〇 Neurobasal的无机盐浓度和摩尔渗透压浓度与神经元在脑中自然情况下所处的那些不同 [Davson and Segal，1996]。作为很可能的后果，发现Neurobasal显著地减少电压依赖的 钠电流并快速失活钾电流，并影响诱发的和自发的动作电位的幅度和频率（η = 8/8细胞； 图lc)。首先试验在Neurobasal中增加 NaCl的浓度，然而，尽管在电压依赖的钠电流的幅 度中有一些轻微改善，该改良足以优化人神经元的电活性和突触活性。因而怀疑，同在DMEM 中那样，Neurobasal中的一些神经活性组分防止神经生理活性。由于DMEM或Neurobasal 均无法维持必要的电生理神经元特性例如动作电位放电和突触功能，设计出更好地适应神 经元功能的新的基础培养基。
[0135] 亲斤的BrainPhys基础]培养基支持功會卜性云力作电位放;.电
[0136] 神经元功能在根本上基于动作电位的产生和传播。电压依赖的钠（Nav)和钾（Kv) 通道对于实现动作电位的高发放率是关键的。动作电位反映出顺序激活Nav和Κν通道，其 引发在很大程度上取决于离子梯度的较大钠流出和钾电流流入。因而，BrainPhys的首次 改进是将无机盐浓度调整为接近神经生理水平（例如，Na+、Cl-、K+、Ca2+)。在电压钳中 的测试示出，在ACSF和BrainPhys中的Nav和Kv电流的幅度没有不同（图2a)。结果，在 BrainPhys中测试的单个神经元中，自发的和诱发的动作电位也在相当程度上得以改进，达 到ACSF中测量的相似水平（η = 3细胞；图2b)。相似地，在ACSF和BrainPhys中进行钙 成像以网络水平测定的自发活性是相当的。
[0137] 此外，已示出，光基因例如视紫红质通道蛋白（ChR2)或Cheta可以在人神经元中 高效地表达，并使我们在BrainPhys中通过简短的闪光来远端控制神经元的放电活性（图 2c)。在强烈的对比中，在BrainPhys中成功诱发反应的神经元LED刺激无法在Neurobasal 或DMEM中诱发明显的动作电位（图2d)。与放电活性的整体改进一致，当在BrainPhys或 ACSF中记录时，与Neurobasal相比，Nav和快速失活Kv电流的振幅整体上较大（图2e)。
[0138] 亲斤的BrainPhys支持功會κ兴奋f生矛口才卬制十生突角虫^舌十生
[0139] 整合的神经网络活性和根本的脑功能通过神经元之间的突触通讯实现。因而，我 们设计BrainPhys以保持兴奋性和抑制性突触功能两者。兴奋性和抑制性突触神经递质 的总和确定神经元发放动作电位的可能性。因而，简单地通过支持最优的动作电位放电， BrainPhys间接作用于促进突触活性。此外，特定的离子例如钙在突触中起到引发快速囊 泡释放的关键作用。为设定尽可能逼真的体外条件，我们将BrainPhys中的钙水平调整为 接近于人体内脑脊液中报道的那些水平（Ca2+~l.lmM)。然而，基于示出在灌注DMEM或 Neurobasal时较强Na+和/或C1-电流的电压钳实验，我们强烈怀疑，突触功能也因为神经 活性组分的存在而破坏。
[0140] 脑中主要的兴奋性突触联系通过谷氨酸介导，而大多数突触抑制通过GABA介导。 因而，排除或减少经典培养基中可以直接影响谷氨酸能和gaba能突触活性的神经活性元 素。为控制那些改良改进突触功能，在电压钳中测试由AMPA或GABAa受体介导的自发的谷 氨酸能和GABA能突触活性的水平（通过用它们各自的拮抗剂NBQX或SR95531进行可逆阻 断而示出）。尽管细胞间的自发活性会不同，但配对分析清楚地示出，在BrainPhys中，自发 的AMPA突触活性的水平没有显著不同于ACSF中的那些（η = 5细胞，ACSF :11. 0±10Hz， BrainPhys :12. 8± 10Hz)，因而与DMEM或甚至Neurobasal相比，在较大程度上有改善（图 2f)。
[0141] 在整体上发现，Neurobasal和DMEM均完全地阻断突触抑制性阶段性活性（在 Neurobasal中，η = 4/4细胞；图lc)。由于GABA突触活性的阻断伴随有较大的氯电流流 入（图14)，怀疑该阻断是由于使氯离子型通道饱和的神经活性组分的存在而引起。
[0142] 遵循该假设，已证实降低作用于氯离子通道的特定神经活性组分的浓度大幅度地 改善GABA能突触活性。作为那些改良的结果，证明自发的GANA突触活性在BrainPhys中 起作用（η = 7细胞；图2f)并与ACSF中的活性水平相当（η = 3细胞）。
[0143] 总而言之，这些结果示出，DMEM和Neurobasal中存在的神经活性组分的非生理浓 度强烈破坏兴奋性和抑制性突触活性。因而，在BrainPhys的配制中，确定该关键的告诫， 并且已经示出，突触通讯在BrainPhys中是