个优选方案是，所获得的乳清抗氧化肽的分子量在500~800D，肽含量不低于 2. lg/L，纯度不低于94%，自由基清除率不低于41 %。
[0043]应用上述方法生产乳清抗氧化肽，具体为：
[0044] 实施例1
[0045] 浓缩乳清粉加蒸馏水按，120°C条件下灭菌20min，冷却后在超净台中接入适量菌 种，置于培养箱中静止发酵。发酵温度:37°C，初始pH值:6.5，接种量:5 %，发酵时间：24h，发 酵结束后，调节发酵液pH至7.5，8000r/min离心30min后，取上清液冷藏保存备用。
[0046] 取适量大孔吸附树脂（型号:HPD400(A))，用95 %乙醇浸泡24h，充分溶胀后用蒸馏 水洗净备用，将乳清蛋白酶解物以3000rpm离心20min，取上清液；取一支层析柱（Φ 1.0 X 100cm)，装入已处理好的HPD400(A)的大孔吸附树脂对上清液进行真空抽滤，去除沉淀物。 再用截留分子量为100D和1000D超滤膜进行除杂和除盐，滤液待用。
[0047] 取交联葡聚糖凝胶SephadexG-25层析柱，用去离子水以lmL/min流速洗柱约2h，待 基线走平，把处理好的乳清蛋白酶解液加入层析柱中，再以质量分数为60%乙醇溶液洗柱 约6h，洗脱至基线走平，最佳收集时间为7.5h，用截留分子量为6000D的超滤膜对洗脱液进 行超滤浓缩除盐。真空干燥6h得乳清康氧化肽。检测乳清抗氧化肽分子量450D的乳清抗氧 化肽占到84%，肽含量为2.564g/L，纯度为94.1 %，清除率为42.37%。
[0048]其中，应用采用分光光度法检测各管中TBARS值，比较各个时间段下的清除DHHP自 由基和纯度，确定最佳的收集时间；
[0049] 收集抗氧化能力较高的解析液，用截留分子量为6000D的超滤膜对洗脱液进行超 滤浓缩除盐。真空干燥6h以上得乳清抗氧化肽；
[0050] 在波长325nm处每30s测定一次吸光值A，计算线性范围内每分钟A的增值，此即为 邻苯三酚的自氧化速率Ao;
[0051] 乳清抗氧化肽活性测定按上述操作，加入邻苯三酚前，先加入一定量样液，并减少 同体积双蒸水，其它操作均与上述相同，所测吸光度为Ai。
[0052]
[0053] 实施例2
[0054]浓缩乳清粉加蒸馏水按，120°C条件下灭菌20min，冷却后在超净台中接入适量菌 种，置于培养箱中静止发酵。发酵温度:40°C，初始pH值:6.5，接种量:4 %，发酵时间：22h，发 酵结束后，调节发酵液pH至7.5，8000r/min离心30min后，取上清液冷藏保存备用。
[0055] 取适量大孔吸附树脂（型号:HPD450(A))，用95 %乙醇浸泡24h，充分溶胀后用蒸馏 水洗净备用，将乳清蛋白酶解物以3000rpm离心20min，取上清液；取一支层析柱（Φ 1.0 X 150cm)，装入已处理好的HPD450(A)的大孔吸附树脂，进行真空抽滤，去除沉淀物。再用截留 分子量为100D和800D超滤膜进行除杂和除盐，滤液待用。
[0056] 取交联葡聚糖凝胶SephadexG-25层析柱，用去离子水以lmL/min流速洗柱约2h，待 基线走平，把处理好的乳清蛋白酶解液加入层析柱中，再以质量分数为60%乙醇溶液洗柱 约6h，洗脱至基线走平，最佳收集时间为7.5h，用截留分子量为6000D的超滤膜对洗脱液进 行超滤浓缩除盐。真空干燥6h得乳清康氧化肽。检测乳清抗氧化肽分子量450D的乳清抗氧 化肽占到82%，肽含量为2.503g/L，纯度为94.5%，自由基清除率为42.19%。
[0057] 实施例3
[0058]浓缩乳清粉加蒸馏水按，120°C条件下灭菌20min，冷却后在超净台中接入适量菌 种，置于培养箱中静止发酵。发酵温度:45°C，初始pH值:6.3，接种量:3 %，发酵时间：20h，发 酵结束后，调节发酵液pH至7.5，8000r/min离心30min后，取上清液冷藏保存备用。
[0059] 取适量大孔吸附树脂（型号:HPD450(A))，用95%乙醇浸泡24h，充分溶胀后用蒸馏 水洗净备用，将乳清蛋白酶解物以3000rpm离心20min，取上清液；取一支层析柱（Φ 1.0 X 150cm)，装入已处理好的HPD450(A)的大孔吸附树脂，进行真空抽滤，去除沉淀物。再用截留 分子量为100D和800D的超滤膜进行除杂和除盐，滤液待用。
[0000] 取交联葡聚糖凝胶SephadexG-25层析柱，用去离子水以lmL/min流速洗柱约2h，待 基线走平，把处理好的乳清蛋白酶解液加入层析柱中，再以质量分数为60%乙醇溶液洗柱 约6h，洗脱至基线走平，最佳收集时间为7.5h，用截留分子量为6000D的超滤膜对洗脱液进 行超滤浓缩除盐。真空干燥6h得乳清康氧化肽。
[0061 ]检测乳清抗氧化肽分子量450D的乳清抗氧化肽占到85%，肽含量为2.591g/L，纯 度为94.9%，自由基清除率为43.01 %。
[0062]尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地 实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的图例。
【主权项】
1. 乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，以脱盐乳清粉为原料经菌种发酵得到 乳清蛋白抗氧化肽，其中，菌种由乳双歧杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按体积比为1: 1:1混合。2. 如权利要求1所述的乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，将脱盐乳清粉融入 蒸馏水中，制备质量浓度为13.4g/L的脱盐乳清粉溶液，用于接种菌种发酵制备乳清蛋白抗 氧化肽。3. 如权利要求1所述的乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，发酵条件为:发酵 温度:37~47°C，初始pH值:6.0~6.5，菌种接种量占脱盐乳清粉溶液体积的3~5%，发酵时 间：20-24h。4. 如权利要求1所述的乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，发酵条件为:发酵 温度:37~45°C，初始pH值:6.5，菌种接种量占脱盐乳清粉溶液体积的5 %，发酵时间：20-5. 如权利要求1所述的乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，还包括以下步骤： 5.1) 菌种活化:菌种接入MRS液体培养基，37°C静止培养36h活化； 5.2) 发酵:制备所述脱盐乳清粉溶液，将其在100-120°〇条件下灭菌20!^11，冷却后在超 净台中接入适量活化的菌种，置于培养箱中静止发酵获得发酵液； 5.3) 调节发酵液pH至7.5，将发酵液在5000-8000r/min离心25-30min后，取上清液，冷 藏保存备用； 5.4) 超滤:将所述上清液再经2500-3500rpm离心15-20min，取第二上清液;应用规格为 Φ1.0X100cm或Φ1.0X150cm的层析柱，装入已处理好的大孔吸附树脂HPD400A或 HPD450A，对第二上清液进行真空抽滤，去除沉淀物;再用截留分子量为800D-1000D和100D-200D超滤膜依次对经真空超滤后的所述第二上清液进行除杂和除盐，获得滤液，备用； 5.5) 纯化:将所述上清液过交联葡聚糖凝胶SephadexG-25层析柱，收集洗脱液，之后， 应用截留分子量为6000D的超滤膜对洗脱液进行超滤浓缩除盐，真空干燥6h-12h得乳清抗 氧化肽。6. 如权利要求5所述的乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，所述交联葡聚糖凝 胶SephadexG-25层析柱经预处理后使用，预处理的具体方法为：将交联葡聚糖凝胶 SephadexG-25层析柱用去离子水以0.7-lmL/min流速洗柱1.5-2h，待基线走平，备用。7. 如权利要求5所述的乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，所述洗脱液为质量 分数为55-60 %乙醇溶液，应用洗脱液洗柱约5-6h，洗脱至基线走平，用分布收集器进行定 量收集。8. 如权利要求5所述的乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，所述MRS培养基组 成:酵母膏 0.5%、酪蛋白 1%、1?2?〇4〇.1%，]^5〇4〇.02%、牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%、恥(：1 0·5 %、葡萄糖 1 %、CH3C00Na0·28 %、C6H14N2O7O·03 %、pH为6·2-6·4。9. 如权利要求5所述的乳清抗氧化肽的发酵制备方法，其特征在于，所获得的乳清抗氧 化肽的分子量在500~800D，肽含量不低于2.lg/L，纯度不低于94%，自由基清除率不低于 41%〇
【专利摘要】本发明公开了乳清抗氧化肽的发酵制备方法，以脱盐乳清粉为原料经菌种发酵得到乳清蛋白抗氧化肽，其中，菌种由乳双歧杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按体积比为1:1:1混合。应用该方法制备的乳清抗氧化肽是以脱盐乳清粉经微生物发酵得到乳清蛋白抗氧化肽，其分子量在500～800D，肽含量不低于2.1g/L，纯度不低于94％，自由基清除率不低于41％，具有清除自由基效果好、活性肽分子量小、易被肠胃吸收。不仅可作为添加物添加到食品和化妆品中，还可以做成不同类型的保健食品。
【IPC分类】C12R1/46, C12P39/00, C12P21/00, C12R1/01, C07K1/34, C07K1/36, C12R1/225, C07K1/16
【公开号】CN105483201
【申请号】CN201511027678
【发明人】王秀云
【申请人】华远医药研究院有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月30日