[0062] (2)取8ml上清4000rpm离屯、5min后转移上清5ml到事先装有3ml细胞裂解液的新的 15ml罔屯、管中。
[0063] (3)向各离屯、管中加入lOOul捕获磁珠，水浴锅92°C解育lOmin;室溫摇床l(K)rpm解 育化，简短离屯、后置于磁力架5min，丢弃上清。
[0064] (4)利用下述捕获探针，可W抓到目的片段。
[00巧]捕获探针 1:TCC CTC GCG CGT GGC TTC CGC CTT CTG CGC GGC TGG GGT GCC CGG TGG
[0066] (5)向15ml离屯、管中加入500ul洗涂液，振荡摇匀，使管壁磁珠完全悬下来，简短离 屯、后转移到新的2ml离屯、管中。室溫干浴器9(Κ)巧m解育Imin，置于磁力架上Imin，弃上清。重 复4次。
[0067] (6)加入55μ1洗脱液，简短离屯、，干浴器92°C90化pm解育lOmin。简短离屯、，置于磁 力架上，3minW内转移50ul洗脱液到新的EP管中。
[006引 （7)用EZ methylation kit(Zymo Research公司产品）对第6步中的DNA片段进行 甲基化处理，最后的样品进行PCR检测。
[0069] 2、PCR体系和程序分别如表3、表4所示。
[0070] 表3 PCR体系
[0071]
[0072] 表4 PCR程序
[0073]
[0074] 实施例3引物探针优化
[0075] 按照实施例2的方法，分别利用实施例1设计的各组引物和探针进行检测，优化引 物和探针。结果如下：
[0076] 1、引物优化
[0077] 如表5和附图1~5所示，5组引物组的扩增结果显示，最优引物组为NDRG4-1FP/ NDRG4-1RP。
[007引 表5
[0079]
[0080] 2、探针优化
[0081 ] 如表6和附图6~8所示，3条探针组的扩增结果显示，最优探针为NDRG4-2Pb。
[0082]表 6
[0083]
[0084] 实施例4试剂盒组装
[008引1、经过上述研究分析，最终得到最优的检测引物、探针，W及DNA捕获
[0086] 探针如下表7所示：
[0087] 表 7 [008引
[0089] 2、组装试剂盒
[0090] 检测试剂盒包括W下组分：
[0091] (1)引物NDRG4-1FP和NDRG4-1RP，其核巧酸序列分别如沈Q ID N0.1和2所示。
[0092] (2)探针NDRG4-2Pb，其核巧酸序列如沈QIDN0.3所示。
[0093] (3)捕获探针NDRG4-CP，其核巧酸序列如SEQ ID N0.4所示。捕获探针NDRG4-CP的 作用是提取待测样品DM时捕获目的片段。
[0094] (4)PCR扩增体系试剂，lOmM的dNTP、25mM的儀离子、5 X反应缓冲液(5 Xbuffer)、 酶、无核酸酶的水。
[0095] (5)样品（如粪便)预处理试剂:研磨缓冲液。所述研磨缓冲液具体为:无核酸酶的 水、生理盐水、TE、或PBS中的一种或多种。
[0096] 3、试剂盒使用方法
[0097] (1)经过大量的实验和研究显示，利用上述试剂盒进行NDRG4基因甲基化检测时， 最佳的PCR体系按照如下比例进行： 1嘶μ说巧正向引物 0.125,uL 100μΜ的反向引物 0.125nL 100μΜ 蛛探针 0.05mL lOmM 的 dNTP ΙμΙ^
[009引 25mM的簇离子 5,liL 5*bu!Tcr 5liL n. 0.引止 无核酸酶的水 8.2yL 挣测DNA 5|正。
[0099] (2)经过大量的实验和研究显示，利用上述试剂盒进行NDRG4基因甲基化检测时， 最佳的PCR程序如下：
[0100] 95°C300s;l 个循环；
[0101] 95°C20s，62°C30s，70°C30s; 10个循环；
[0102] 95°C20s，58°C60s，72°C30s; 35 ~40 个循环；
[0103] 37°C30s;l 个循环。
[0104] 实施例5样品检测
[0105] 1、临床收集W下Ξ种粪便样本：
[0106] (1)46例肠镜及病理检查确诊为肠癌患者的粪便样本(肠癌，化）；
[0107] (2)46例肠镜及病理检查确诊为癌前腺瘤(息肉直径含1cm)的患者的粪便样本(癌 前腺瘤，LA);
[0108] (3)46例肠镜检查确诊为正常患者的粪便样本(正常，Norm)。
[0109] 2、利用实施例4所组建的试剂盒对W上粪便样品进行检测，使用MedCalc软件对数 据进行处理分析。
[0110] 3、NDRG4基因检测结直肠癌和癌前腺瘤的结果如图9所示。其中，图9A为NDRG4基因 检测结直肠癌的R0C曲线；图9B为NDRG4基因检测癌前腺瘤(息肉直径> 1 cm)的R0C曲线。
[0111] 结果显示，对于结直肠癌，本发明上述试剂盒对NDRG4基因的检测敏感性为 65.2 %，特异性为97.8 %，受试者曲线下面积为0.826。
[0112] 对于癌前腺瘤（息肉直径含1cm)，本发明上述试剂盒对NDRG4基因检测敏感性为 45.7%，特异性为97.8%，受试者曲线下面积为0.694。
[0113] 综上所述，本发明的引物和探针及其检测试剂盒不仅能够更灵敏、更准确的检测 诊断结直肠癌，尤其是早期结直肠癌，而且对于癌前腺瘤也具有很好的检测灵敏性和很高 的特异性，可在癌前腺瘤阶段就实现检测诊断的目的。
【主权项】
1. 一组用于肠癌早期诊断的NDRG4基因甲基化检测引物和探针，其特征在于，所述引物 为NDRG4-1FP和NDRG4-1RP，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1和2所示；所述探针为NDRG4-2Pb，其核苷酸序列如SEQIDN0.3所示。2. -种用于肠癌早期诊断的NDRG4基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂 盒包含有权利要求1所述引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探针NDRG4-2Pb。3. 根据权利要求2所述检测试剂盒，其特征在于，还包括利用引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探针NDRG4-2Pb进行PCR扩增时，获得PCR模板所需试剂，所需试剂包括提取待测样品 DNA时捕获目的片段的捕获探针NDRG4-CP，捕获探针NDRG4-CP的核苷酸序列如SEQ ID N0.4 所示。4. 根据权利要求2所述检测试剂盒，其特征在于，所述引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探 针NDRG4-2Pb的使用浓度均为50~500μΜ。5. 根据权利要求2所述检测试剂盒，其特征在于，还包括利用引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探针NDRG4-2Pb进行PCR扩增时，PCR扩增体系试剂，包括dNTP、镁离子、反应缓冲液、 酶、无核酸酶的水。6. 根据权利要求5所述检测试剂盒，其特征在于，所述体系试剂包括5~20mM的dNTP、10 ~40mM的镁离子、1 X~10 X反应缓冲液、酶、无核酸酶的水。7. 根据权利要求5所述检测试剂盒，其特征在于，利用该试剂盒进行NDRG4基因甲基化 检测时，PCR体系中各组分的反应终浓度如下： 正向引物 0.1~2μΜ 反向引物 0.1~2μΜ 探针 0.1~ΙμΜ dNTP 0.1 ~2mM 镁离子 2~10mM 反应缓冲液 1 X反应体系总体积 酶 0.1U~0.6UAiL 无核酸酶的水1X反应体系总体积。8. 根据权利要求5所述检测试剂盒，其特征在于，所述酶为热启动聚合酶。9. 根据权利要求2所述检测试剂盒，其特征在于，利用该试剂盒进行NDRG4基因甲基化 检测时，PCR程序如下： 95°C 300s;l个循环； 95°〇2〇8,62°〇3〇8,70°〇3〇8;10个循环； 95°〇2〇8,58°〇6〇8,72°〇3〇8;30~40个循环； 37°C 30s;l个循环。10. 根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于，所述待测样品为粪便，所需试剂还包 括粪便预处理试剂，预处理试剂为研磨缓冲液。
【专利摘要】本发明公开了一组用于肠癌早期诊断的NDRG4基因甲基化检测引物和探针及其检测试剂盒。所述引物为NDRG4-1FP和NDRG4-1RP，其核苷酸序列分别如SEQ？ID？NO.1和2所示；所述探针为NDRG4-2Pb，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.3所示。所述试剂盒为包含有上述引物和探针的试剂盒。本发明利用上述引物和探针，构建了一套NDRG4基因甲基化检测体系和程序，并组建成试剂盒，对于NDRG4基因甲基化的检测，具有高敏感性和特异性，能够准确特异地诊断早期肠癌，而且检测方法操作简便、快速，对肠癌的早期诊断和筛查具有非常重要的意义和应用前景。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105543378
【申请号】CN201610048731
【发明人】邹鸿志, 吴珊, 牛智通, 赵荣淞, 余浩
【申请人】广州市康立明生物科技有限责任公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月23日