育前)测量的菌种生长的吸光度。
[0135] Tf生长=不存在样品时，在最后时间(解育后)测量的菌种生长的吸光度。
[0136] ToBlank =在加寸间（解育前)ii量的培养液(空白）的吸光度。
[0137] Tf Blank =在最后时间(解育后)测量的培养液(空白）的吸光度。
[0138] 化合物MDN-0057和化合物MDN-0058显示抗大肠杆菌、绿脈杆菌、鲍氏不动杆菌和 克雷伯氏肺炎菌的菌种的MIC值为2-64yg/mL。没有显示出抗金黄色葡萄球菌（12祉g/mL)或 真核细胞(〉51化g/mU的活性。化合物MDN-0059和MDN-0060显示出抗绿脈杆菌野生型菌种 的MIC值为16-6化g/mL，抗鲍氏不动杆菌的MIC值为0.5-2yg/mL(表6)。
[0139] 表6对四种测试化合物获得的抗细菌性MIC
[0140] MIC(yg/mL)
[0141]
[01创实施例7:抗性生物实验中的抗性评估
[0143] 用大肠杆菌acrAB: :Tn903(CB-219)和野生型(WT)鲍氏不动杆菌(ATCC BAA-747) 来评估MDN-0057和MDN-0058的抗性的频率。出于此目的，MDN-0057对于每种菌株的最小抑 制浓度通过培养液微稀释法来确定，所述培养液微稀释法在临床实验室标准研究院出版物 (Clinical Laboratory Standards Institute publication)M07-A9,Vol.32,Νο.2., "Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically ;App;roved Sl:andard-化nth Edition,"2012年 1 月"中描述。用比MIC高4 倍和8倍的浓度的MDN-0057和MDN-0058制备包括Mueller Hinton II琼脂(每孔5mL)的六孔 板。使培养物生长到晚对数生长期，并散步在琼脂上。在37°C下解育板，并在解育1天和2天 之后进行检查。
[0144] 对于鲍氏不动杆菌，解育24小时之后，在高于培养液MIC 4倍和8倍浓度的MDN- 0057板中，明显有一堆菌落。对于大肠杆菌acrAB: : Τη903，解育48小时之后，在高于培养液 MIC 4倍和8倍浓度的MDN-0057板中，明显有多到数不清的细小的菌落。来自每个物种的6-8 个分离物通过对于无抗生素的膜蛋白酶大豆琼脂板上的板的生长物重新划线获得，随后确 定MDN-0057对于分离物的MIC。大肠杆菌分离物相对于其亲本菌株CB-219，MIC提高了至少 16-64倍。相反，鲍氏不动杆菌分离物的MIC与其亲本菌株鲍氏不动杆菌BAA-747并没有明显 不同。
[0145] 表7.大肠杆菌CB-219对于MDN-0057和MDN-0058的微RI生物实验
[0146]
[0147] 实施例8:用大分子标记实验对行为模式的评估
[0148] 测量大分子的细胞内构造块的抑制的大分子合成实验对理解化合物的广M0A提供 了指导。
[0149] 对在脂质、细胞壁、DNA、RNA和蛋白质合成通路中的大分子合成的抑制效果在大肠 杆菌acrAB::Tn903的生长细胞中确定。细胞在膜蛋白腺大豆琼脂中，在35°C下过夜生长，用 该培养物接种15ml的Mue 1 ler化nton培养液II (MHB)。在35°C、200巧m的条件下在摇床中解 育的同时，使培养物生长到指数生长阶段早期(00600 = 0.2至0.3)。
[0150] 将指数生长阶段早期的细胞暴露于MDN-0057,测定其在各种通路下的放射性前体 渗入。分别包括利福平、环丙沙星、四环素、亚胺培南和氯苯酪作为抑制RNA、DNA、蛋白质、细 胞壁和脂质合成的阳性对照。
[0151] DNA、RNA和蛋白质合成：当细胞到达指数生长阶段早期时，将10化L培养物加入到 一式Ξ份的包含多种浓度的MDN-0057或对照抗生素(2.扣L)的孔中，其为在100%DMS0或去 离子水(地2〇)中的40倍稀释的最终浓度。在所有实验中，W单独用2.5%DMS0或地2〇处理的 培养物作为"无药"对照。对于蛋白质合成反应，细胞W102.5%的量加入MHBW占加入到每 个反应的药物的体积，或M9基础培养基中。在室溫下解育5分钟之后，基于实验，W每个反应 0.5-1.化Ci的量加入[3H]胸巧(DNA合成）、[3H]尿巧(RNA合成）或者[ 3H]亮氨酸（蛋白质合 成）。使反应在室溫下继续进行15-40分钟，然后通过加入12化冷的5%Ξ氯乙酸(TCA)或5% TCA/2 %酪蛋白氨基酸（蛋白质合成）来停止反应。将反应在冰上解育30分钟，在25mm GF/ 1.2μπι PES 96孔过滤板(Corning)上收集TCA沉淀的材料。用20化L每孔的冷的5%TCA洗涂 五次之后，将过滤器干燥，然后用化ckard Top Count微孔板闪烁计数仪进行计数。
[0152] 细胞壁合成:将指数生长阶段早期的细菌细胞转移至M9基础培养基中，加入到包 括多种浓度的MDN-0057或者对照抗生素(2.5化)的1.5ml微量离屯、管（100化/管）中，其如上 所述，在100 %DMS0或地2〇中的40倍稀释最终浓度下。在37°C下解育5分钟之后，对每个管加 入[14C]N-乙酷氨基葡萄糖(0.4μα/反应），在37°C加热器中解育30分钟。往每个管中加入 10化1 8%SDS来停止反应。然后在加热器中95°C加热反应30分钟，冷却，短暂离屯、，并点在 预先湿润过的HA滤纸上（0.45μΜ)。用化L 0.1 %SDS洗涂Ξ次之后，用5mL地2〇清洗滤纸两 次，干燥后，再用Beckman LS3801液体闪烁计数仪进行计数。
[01对脂质合成:将细菌细胞在MHB中生长至指数生长阶段早期，将100化加入到包含如 上所述的多种浓度的MDN-0057或者对照抗生素的1.5ml微量离屯、管（一式Ξ份）中。在室溫 下解育5分钟之后，W0.扣Ci每个反应加入[3H]甘油。将反应在室溫下继续进行40分钟，然 后通过加入37扣L氯仿/甲醇（1:2)并在每次加入之后满旋震动20秒来停止反应。然后往每 个反应中加入氯仿（125化）并满旋震动，然后加入125μΙ dH2〇并满旋震动。将反应在 130(K)rpm下离屯、10分钟，然后将15化L的有机相转移至闪烁管，使其在通风楓中干燥至少1 小时。然后通过液体闪烁计数仪对样品进行计数。
[0154] MDN-0057对大肠杆菌acrAB: :Τη903中的大分子合成的作用在图1中显示。当将大 肠杆菌acrAB: : Τη903细胞暴露于高达MIC的8倍的MDN-0057时，没有或几乎没有发生对于 RNA、DNA、蛋白质或脂质合成的抑制。存在细胞壁合成的明显的剂量反应抑制，在2-8倍MIC 时出现约为75 %的最大抑制。
【主权项】
1. 通式(I)的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、前药或溶剂化物，其中，Ri、R哺R3各自独立地选自氨和径基保护基团；并且 二表示单键或双键。2. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，Ri、R2和R3各自独立地为Η或选自下列各 项的径基保护基团： -式-R'的酸基类； -式-C(=0)R'的醋基类；W及 -式-C(=0)0R'的碳酸醋基类； 其中，R'可独立地选自取代的或未取代的烷基，W及取代的或未取代的芳基。3. 根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，所述径基保护基团独立地选自甲酸 基、叔下基酸基、苄基酸基、对甲氧基苄基酸基、3,4-二甲氧基苄基酸基、Ξ苯甲酸基、締丙 酸基、甲氧基甲酸基、2-甲氧基乙氧基甲酸基、节氧基甲酸基、对甲氧基节氧基甲酸基、2- (Ξ甲基甲娃烷基）乙氧基甲基、1-甲氧基乙酸基、1-乙氧基乙酸基、1-正丙氧基乙酸基、1- 异丙氧基乙酸基、1-正下氧基乙酸基、1-异下氧基乙酸基、1-仲下氧基乙酸基、1-叔下氧基 乙酸基、1-乙氧基正丙酸基、甲氧基丙酸基、乙氧基丙酸基、1-甲氧基-1-甲基乙酸基、1-乙 氧基-1-甲基乙酸基；四氨化喃基；乙酸醋基、径基乙酸醋基、苯甲酸醋基、特戊酸醋基、甲氧 基乙酸醋基、氯代乙酸醋基、乙酷丙酸醋基、苄基碳酸醋基、对硝基苄基碳酸醋基、叔下基碳 酸醋基、2,2,2-Ξ氯代乙基碳酸醋基、2-(Ξ甲基甲娃烷基）乙基碳酸醋基、締丙基碳酸醋 基。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其特征在于，Ri为Η。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的化合物，其特征在于，R2为H、-COC出或-COC出0H。6. 根据权利要求1-5中任一项所述的化合物，其特征在于，R3为Η或Ci-Ci8烷基。7. 根据权利要求6所述的化合物，其特征在于，R3为C1-C4烷基。8. 根据权利要求7所述的化合物，其特征在于，R3为甲基。9. 根据权利要求1-8中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自由下列各项 组成的组中：或其药学上可接受的盐、立体异构体、前药或溶剂化物。10. 根据权利要求9所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自由下列各项组成的组 中：或其药学上可接受的盐、前药或溶剂化物。11. 药物组合物，其包括根据权利要求1-10中任一项所述的式（I)的至少一种化合物、 或其药学上可接受的盐、立体异构体、前药或溶剂化物，W及药学上可接受的赋形剂。12. 根据权利要求1-10中任一项所述的化合物在药物中的应用。13. 根据权利要求1-10中任一项所述的化合物在治疗和/或预防细菌性感染疾病中的 应用。14. 根据权利要求1-10中任一项所述的化合物在根据权利要求13所述的应用中的应 用，其特征在于，所述细菌性感染疾病由革兰氏阴性细菌引起。15. -种获取根据权利要求1-10中任一项所述的通式（I)的化合物、或其药学上可接受 的盐、立体异构体、前药或溶剂化物的方法，所述方法包括如下步骤:在具有可吸收碳源和 氮源和盐的含水营养培养基中、在受控的水中有氧条件下培养O.korrae CBS 102216的菌 株，然后从培养液回收并纯化通式(I)的化合物。
【专利摘要】本发明涉及通式(I)的组合物(其中，R1、R2、R3和＝＝＝＝具有多种含义)、包括所述化合物的药物组合物及其在药物中的应用，尤其是在治疗和/或预防细菌性感染疾病中的应用
【IPC分类】A61K31/277, C07C291/10, A61P1/00
【公开号】CN105555759
【申请号】CN201480038465
【发明人】奥尔加·格尼罗德·罗德里格斯, 约瑟·鲁本·托莫·贝尔特伦, 约瑟·费尔南多·雷耶斯·贝尼特斯, 努尔丁·埃勒·阿瓦德, 玛丽亚·弗朗西斯卡·韦森特·佩雷斯, 梅赛德斯·德·拉·克鲁兹·莫雷诺, 杰拉德·弗里蒙特·比尔斯, 维克托·曼纽尔·冈萨雷斯·梅内德斯, 玛丽亚·坎迪德·蒙蒂罗·德·阿吉亚尔
【申请人】麦地那创新药物研究中心基金会
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年6月30日
【公告号】CA2916573A1, EP2821394A1, US20160185717, WO2015000825A1