安全性实验
[0142] 1、氨基酸衍生物对L929细胞毒性实验
[0143] 细胞培养与细胞毒性评估
[0144] L-929细胞在37±1°C的5% ±1%的二氧化碳的气态环境中和包含推荐介质的组 织培养瓶的湿润环境中，添加10%胎牛血清和青霉素（lOOunits)、链霉素（100 μ g)等抗生 素（美国Invitrogen公司）的细胞培养基（美国Invitrogen公司）中培养，以达到实验要 求的细胞密度。用PBS漂洗单层细胞两次，将PBS吸走，在0. 25 %胰蛋白酶/EDTA，37 ± 1 °C 的组织培养瓶中消化，直到细胞分离和浮动。
[0145] 通过我们设计合成的化合物2、3、4、6、7、8对L929细胞的体外细胞毒作用，并按照 ISO 10993-part 5的细胞株的形态分析执行。
[0146] 表1化合物毒性的定性形态分级
[0147]
'〇
[0148] 测试项目，观察化合物2、3、4、6、7和8对L929细胞的体外细胞毒作用。各种 化合物均采用5%的DMEM进行稀释，配制浓度至100 μM，并分别稀释至50 μM，25 μM， 12. 5 μ Μ，6. 25 μ Μ的5 %的DMEM稀释液，分别加入5 % C02培养的L-929老鼠成纤细胞的融 合单层细胞中。另外独立的三份测试液分别为阳性对照（顺铂，阳性对照），阴性对照（生 理盐水）和溶媒对照（5%DMEM)。所有的测试液都在温度为37±1°C的5% ±1%0)2中 培养24小时。单层细胞在测试中显阳性，试剂对照试液在经过培育后，在显微镜下被检测 24±1小时去判定细胞形态的任何变化。
[0149] 结果
[0150] 在此研究的条件下，化合物2、3、4、6、7、8在100以]?的浓度下，24±1小时的观察， 发现对L-929细胞毒性较低或者没有明显的细胞毒性。
[0151] 经过24小时后温育后，形态观察和生物反应，结果见表2。
[0152] 表2受试药化合物毒性的定性形态分级
[0153]
[0154] 。
[0155] 结论
[0156] 化合物2、3、4、6、7、8对L929细胞的毒性结果表明，在100μΜ、50μΜ，25μΜ， 12. 5 μ Μ，6. 25 μ Μ的5%的DMEM稀释液作用于L929细胞，经过24小时观察，在最大浓度 100 μ Μ时发现没有明显的细胞毒性。
[0157] 2、氨基酸衍生物的体外癌细胞的杀伤实验（IC5。）
[0158] 实验材料及仪器
[0159] 药物2、3、4、6、7、8、对照品顺铂，人肺癌財60、!11650、3?(：-六-1、六549细胞株、肝癌 HepG2细胞株、乳腺癌MCF-7细胞株、结肠癌HT-29细胞株、前列腺癌PC-3、DU145细胞株、宫 颈癌Hela细胞株、胃癌MGC-803细胞株、DMEM培养基、10% FBS小牛血清、MTT试剂、DMS0、 96孔板、酶标仪等。化合物2 (20140701)、化合物3 (20140506)、化合物4 (20140305)、化合 物6 (20140508)、化合物7 (20140602)、化合物8 (20140304)来自申请人实验室的合成。
[0160] 实验方法及步骤
[0161] 1)收集对数期细胞；
[0162] 2)调细胞数为4 X 103个/L，每孔加100uL ;
[0163] 3)培养12小时；
[0164] 4)添加受试药和阳性对照药浓度梯度分别为0. 5、2. 5、5. 0、10、25、50、100 μΜ浓 度的药物及0. 5、2. 5、5. 0、10、25、50、100 μ Μ浓度的阳性对照药物顺铂；另外设溶媒对照组
[0165] 5)培养 24 后，每孔加 MTT (5mg/ml)溶液 20 μ 1 ;
[0166] 6)孵育4h，终止培养，吸弃上清液；
[0167] 7)加 DMSOlOOul/ 孔，振荡 lOmin ;
[0168] 8)置酶标仪测定，λ = 490nm ;
[0169] 9)记录结果，绘制图表。
[0170] 按下列公式计算药物对细胞的生长抑制率及IC50 :
[0171] IR% = (1-实验组0D值/对照组0D值）X 100%
[0172] 结果：化合物 2、3、4、6、7、8在0.5、2.5、5.0、10、25、50、100以]?的5%的01^]\1稀释 液，分别作用于体外肺癌H460、H1650、SPC-A-1、A549细胞、肝癌Η印G2细胞、乳腺癌MCF-7 细胞、结肠癌ΗΤ-29细胞、前列腺癌PC-3、DU145细胞、宫颈癌Hela细胞、胃癌MGC-803细 胞，经过24小时观察，观察化合物2、3、4、6、7、8对上述细胞的50%抑制率（IC 5。）。
[0173] 化合物2、3、4、6、7、8分别作用于肺癌H460、H1650、SPC-A-1、A549细胞、肝癌Η印G2 细胞、乳腺癌MCF-7细胞、结肠癌ΗΤ-29细胞、前列腺癌PC-3、DU145细胞、宫颈癌Hela细胞、 胃癌MGC-803细胞，经过24小时孵育后采用MTT方法检测抗肿瘤活性发现，化合物2、3、4、 6、7、8有一定抗肿瘤作用（分别见图13~18)，但是与阳性对照组顺铂相比，氨基酸衍生物 的体外其抗肿瘤细胞活性不高。
[0174] 3、小鼠急性毒性实验
[0175] SPF级KM种小鼠，动物饲养在SPF级实验动物室中的独立通风系统（IVC)设施。 群养，自由饮水、进食，实验室温度为20~25°C，湿度为40~70%。动物室条件始终保持 稳定，以保证试验结果的可靠性。饲料和饮水：饲料为SPF级用颗粒鼠料，购自广东省医学 实验动物中心，营养和卫生符合SPF级实验动物要求。饮水自由摄取。
[0176] 临床拟用途径：口服给药。
[0177] 预试资料：申请人自行合成的化合物8 (20140304)以最大剂量，即1800. mg/kg，bw 最大浓度最大体积单次口服给药后，小鼠的死亡率为〇 %。
[0178] 动物分组：取检疫合格、体重符合要求的动物140只，按体重和性别随机分为14 组，每组10只，雌雄各半。受试药物配制：称取化合物8冻干粉针剂，生理盐水溶解配制。 给药途径和次数：单次口服给药。给药容积：l〇ml/kg。动物空腹时间：给药前禁食6~12 小时，给药后禁食4小时。
[0179] 观察与检查：一般观察：给药后立即观察动物的反应情况，并持续观察4小时，以 后每天上午各观察1次，连续观察14天，记录动物中毒表现和特点，毒性反应出现时间、消 失时间和动物死亡时间。
[0180] 体重测定：分别在给药前（山）、给药后24小时（d2)、第4天（d4)、第8天（ds)、第 11天（d n)和第15天（d15)称量动物体重。
[0181] 病理学检查：中毒死亡或濒死动物及时进行剖检，其他动物在观察期结束后进行 剖检，当发现组织器官出现体积、颜色、质地等改变时，则对有改变的组织器官进行病理组 织学检查。剖检的组织器官包括胸腺、心、肺、肝脏、脾、胰腺、肾、肾上腺、胃、肠（十二指肠、 空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠）、淋巴结、膀胱、前列腺、睾丸（连附睾）、子宫、卵巢。
[0182] 观察指标：详细记录动物反应情况，包括外观、行为活动、精神状态、食欲、大小便 及其颜色、皮毛、肤色、呼吸、鼻、眼、口腔有无异常分泌物，体重变化以及死亡等情况。
[0183] 实验结果：14天内，小鼠无死亡，灌胃后小鼠蜷缩，不喜活动，分析是由于药物浓 度过高，灌胃体积过大引起。表明化合物8毒性较低，小鼠最大耐受剂量约1800mg/kg，相当 于人临床拟用剂量的512倍。
[0184] 氨基酸衍生物对细胞能量代谢的影响
[0185] 1.氨基酸衍生物的抗肿瘤能量代谢作用
[0186] 方法：采用美国MEDGRAPHIC公司生产的CCM代谢车，测试前让裸鼠静息无刺激，平 静30分钟后接受测量（测量的指标是吸气和呼气中的0 2、C02以及呼出气量，根据吸气和呼 气中氮气浓度不变的原则，计算出吸气量。由此得出氧气消耗量（V0 2)与二氧化碳产生量 (VC02)，结合24小时尿总氮排出量（N)。测试时的环境湿度为50-65%，温度为18-24°C，大 气压为101~102. 4kPa(758-768mmHg)，并将这些数据输入计算机，用于仪器校正。
[0187] 再根据公式3. 94XV02+1. 11XVC02_2. 17XN，计算出能量消耗。呼吸商按照RQ = VC02/V02计算，非蛋白质呼吸商按照NRQ = (VC02-4. 754XN) = (ν〇2-5. 293XN)计算。求出 氨基酸衍生物对裸鼠荷瘤A549动物模型静息能量代谢REE (Resting Energy Expenditure， 每天能量消耗总量：kj/d)的影响，结果见图19 :
[0188] 化合物 2(20140701)、化合物 3(20140506)、化合物 4(20140305)、化合物 6(20140508)、化合物7(20140602)、化合物8(20140304)来自申请人实验室的合成。从图 19可以看出，在给药后第10天和第14天，模型组与顺铂组和化合物2、3、4、6、7、8组都可以 显著降低肿瘤组织的能量代谢。
[0189] 2. ATP生成作用
[0190] 利用ATP检测试剂盒（ATP Assay Kit)检测荷瘤裸鼠肿瘤组织内的 ATP (adenosine 5'-triphosphate)水平。根据萤火虫焚光素酶（firefly luciferase)化 荧光素产生荧光时需要ATP提供能量研制而成。当萤火虫荧光素酶和荧光素都过量时，在 一定的浓度范围内荧光的产生和ATP的浓度成正比。这样就可以高灵敏地检测溶液中的 ATP浓度。所用检测试剂盒可以检测浓度低达5nmol/L的ATP。而常规的细胞或组织裂解 液中ATP的浓度仅为0. 1-1 μ mol/L，一些常见细胞的细胞内ATP水平约为10nmol/mg蛋白。 检测细胞或组织内ATP浓度时，用本试剂盒提供的裂解液裂解后即可以测定ATP浓度。
[0191] 化合物 2(20140701)、化合物 3(201405