凝胶电泳（电泳条件： 胶浓度1.2% ;0·5ΧΤΒΕ电泳缓冲液；150v，15min)检测RNA的完整性。用Nano Drop 2000c超 微量分光光度计检测其纯度和浓度。
[0039] 1.2.丹参SmMYB75基因的克隆
[0040] 以所获的〇.5yg丹参总RNA为起始量，用反转录酶XL(AMV)进行第一链cDNA的合成 (操作步骤参照Promega公司提供的相关说明书）。根据所述SmMYB75基因的编码序列（SEQ ID N0.1)，设计扩增出完整编码框的上下游引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性 内切酶位点（这可视选用的载体而定），以便构建载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR 扩增后进行测序。DNA序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。测序结果见 SEQ N0.1。
[0041 ] 实施例2
[0042] 丹参SmMYB75基因的原核表达分析
[0043] 2.1. pET-30a( + ): :SmMYB75载体的构建
[0044]根据已经克隆获得的丹参SmMYB75的0RF序列，设计亚细胞定位载体构建的引物， 构建pET-30a( + ): :SmMYB75,并将pET-30a( + ): :SmMYB75质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)， 挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含有SmMYB75的亚细胞定位载体pET-30a( + ):: SmMYB75已经成功转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，可以用于后续的烟草瞬时表达实验。 [0045] 2.2. SmMYB75重组蛋白的SDS-PAGE分析
[0046] 将构建成功的含有pET-30a( + ): : SmMYB75的大肠杆菌Rosetta(DE3)接种于含有卡 那霉素(75mg/mL)的LB培养基中，培养2-3小时(0D6Q() = 0.4-0.5)。加入0.5毫摩尔的IPTG诱 导剂诱导表达，分别在〇小时、〇. 5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时收集菌液， 12000转/分钟，离心1分钟收获菌体，加入蛋白上样缓冲液，沸水煮沸10分钟，进行SDS-PAGE 电泳分析。结果显示，表达蛋白的大小约为30KD，从SDS-PAGE电泳图可以看到，在IPTG诱导 后，在30KD处与未诱导时相比有明显的的目的条带，说明SmMYB75在此表达体系中成功表 达，且随着诱导时间的增长其诱导表达量明显提高。
[0047] 实施例3
[0048] 丹参SmMYB75的组织表达谱分析
[0049] 为了研究SmMYB75的组织表达模式，分别提取丹参两年生的主根、须根、茎、叶、叶 柄、花瓣、花萼、花丝八个组织的总RNA，并分别进行纯度和浓度检测。然后反转录成cDNA，用 于定量PCR分析SmMYB75的组织表达谱，反应体系用TIANGEN公司提供的SuperReal PreMix (SYBR Green)试剂盒，用SmActin作为内参基因。定量PCR引物为：
[0050]
[00511结果显示，SmMYB75在所检测的所有组织中，在茎、叶和叶柄中表达较强，其次在花 丝和主根中表达较高，在须根、花瓣、花萼中表达较弱(见图3)。
[0052] 实施例4
[0053] 丹参SmMYB75对甲基茉莉酸处理的响应分析
[0054]为了验证Sm MYB75是否响应甲基茉莉酸的诱导，对在摇瓶中培养了60左右大小的 丹参毛状根进行甲基茉莉酸处理，提取经处理不同时间后的丹参毛状根的总RNA，并分别进 行纯度和浓度检测，然后反转录成cDNA，用于定量PCR分析SmMYB75的组织表达谱，定量引物 同实施例3,定量PCR结果显示，在一定的时间范围内，随着甲基茉莉酸的诱导，SmMYB75的表 达量明显上调，在4h时达到最高值，随后表达量下降（见图4)。
[0055] 实施例5
[0056] 丹参SmMYB75基因的亚细胞定位分析
[0057] 5.1. pM0N530: :MYB75载体的构建
[0058]根据已经克隆获得的丹参SmMYB75的0RF序列，设计亚细胞定位载体构建的引物， 构建PM0N530: : SmMYB75，并将pM0N530: : SmMYB75质粒转化农杆菌Ase，挑取单克隆菌落进行 PCR验证。结果表明，含有SmMYB75的亚细胞定位载体pM0N530: :SmMYB75已经成功转化到农 杆菌Ase中，可以用于后续的烟草瞬时表达实验。
[0059] 5.2.在烟草中的瞬时表达
[0060] 用无菌注射器吸取构建好的含有载体pM0N530: :SmMYB75和空载体的pM0N530的工 程菌Ase对生长良好的烟草叶片进行瞬时转化，光照培养，40-48小时后取叶片于载玻片上， 背面朝上，用双蒸水浸润，用盖玻片固定叶片（避免产生气泡），于激光共聚焦显微镜下观 察。结果显示，SmMYB75在细胞核中表达，与它们作为转录因子的功能是一致的(见图5)。 [0061 ] 实施例6
[0062] 含丹参SmMYB75基因的植物过表达载体的构建
[0063] 载体构建模式图见图1。以pCAMBIA2300+为表达载体，将克隆得到的SmMYB75基因 替换 PCAMBIA2300 +上的 gus 基因。具体地，Spe I/BstPI 双酶切 pMD18-T: : SmMYB75 和 PCAMBIA2300+;回收SmMYB75基因和pCAMBIA2300+大片段;连接转化，挑取单克隆菌落PCR筛 选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，SmMYB75基因已被成功构建到植物表达 载体PCAMBIA2300+中，从而获得含SmMYB75基因的植物过表达载体pCAMBIA2300+: : SmMYB75。
[0064] 本实施例将转录因子SmMYB75基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含 SmMYB75基因的植物过表达载体pCAMBIA2300+: : SmMYB75，该表达载体可用于通过代谢工程 策略来提高丹参中丹酚酸的含量。
[0065] 本实施例中以pCAMBIA2300+为中间表达载体是一种优选实施方式，在实际构建载 体的过程中，可以根据具体情况选择其他合适载体，在选用不同的载体时，引入限制性内切 酶位点不同。
[0066] 实施例7
[0067] 发根农杆菌介导的丹参SmMYB75基因遗传转化丹参获得转基因丹参毛状根
[0068] 7.1.含植物表达载体的发根农杆菌工程菌的获得
[0069] 将实施例2中含SmMYB75基因的植物过表达载体pCAMBIA2300+: :SmMYB75转入发根 农杆菌C58C1中，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含SmMYB75基因的植物过表达载 体PCAMBIA2300+: : SmMYB75已经成功转化到发根农杆菌C58C1中。
[0070] 7.2.发根农杆菌介导SmMYB75基因遗传转化丹参 [0071] 7.2.1外植体的预培养
[0072]剪取丹参健壮无菌苗叶片(0.5cm2)，接种到预培养培养基（1/2MS)上，25°C暗培养 2天。
[0073] 7.2.2农杆菌与外植体的共培养
[0074]将上述预培养的丹参叶片外植体，放入含活化好的上述发根农杆菌工程菌的1/ 2MS悬液中浸泡10分钟(轻轻摇晃是外植体与菌液充分接触）后，取出浸染后的丹参叶片用 无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养培养基1/2MS中，暗培养2-3天。
[0075] 7.2.3毛状根的诱导和继代培养
[0076]将上述的共培养2-3天的丹参外植体转接到除菌固体培养基（1/2MS+Cb300mg/L) 中，25°C暗培养2-3周左右，可从外植体伤口处长出毛状根。将已经发根的丹参外植体转接 到除菌固体培养基（1/2MS+Cb200mg/L)上，25°C暗培养2周待毛状根长至3cm以上时剪取单 克隆毛状根作为一个无性系，继续接种于除菌培养基（1/2MS+Cb100 mg/L)中暗培养两周，直 至无溢菌现象。将单克隆毛状根转接到无抗生素的1/2MS培养基上继续暗培养。
[0077] 7.3.转基因丹参毛状根的PCR检测
[0078] 7.3.1转基因毛状根基因组DNA的提取
[0079]采用CTAB法提取转基因毛状根基因组DNA。剪取3.2.3中除菌完毕的转基因毛状根 5cm左右放入1.5mL离心管中，加入600yL CTAB裂解液(65°C预热，含1 巯基乙醇），用组 织研磨仪充分研磨。置于65 °C水浴锅中40-50分钟，其间多次混匀样品（次/15min)，冷却至 室温后加入等体积的苯酚/氯仿（1:1)，轻轻颠倒混匀乳化lOmin，1200rpm离心15min，小心 吸取上清于新EP管中，加入等体积的氯仿混勾，12000rpm离心15min，缓慢吸取上清于新EP 管中，加2倍体积预冷的无水乙醇(于-20°C放30min)，析出沉淀，12000rpm离心15min，弃上 清，加入75 %乙醇洗涤两次，吸出上清，室温晾干，加入30-50yL水溶解沉淀，用RNA酶处理后 于-80 °C超低温冰箱冻存，备用。
[0080] 7.3.2引物设计及PCR检测
[0081 ] 在pCAMBIA2300+: :SmMYB75载体的插入基因（SmMYB75)及NOS终止子上分别设计特 异性上游及下游引物，同时在发根位点基因 BrolB上设计特异性上下游引物。同时用PCR方