10>7 <211>22 ^.212> DNA <213> SmPAL I -2119QR 引物 I 列 <4 0 0 7 CGAACTAGCA CiATTCGCAGA GG 22 <21:08 <211>22 <212> DNA <213> SmTAT-227QF 引物序列 <400> 8 CAACTGCTGG TCTTCCACAA AC 22 <210>9 <21]>17 <212> DNA
[0114] <213> SmTM-353QR 引物序列 <400> 9 GCGACJCX'AAA ACGUACA 17 <21010 <2 Η >22 <212>DNA <213> :SmC4H，1021QF 引物序列 <400> 10 CCAGGAGI C：C AAAIAACAGA GC 22 <210>]1 <211>22 <212> DNA <213〉S:mC4H-]_183QR 引 t!序列： <400> 11 GCCACCAAGC GTTCACCAAG AT 22 <2I0>12 <21 I>21 <212> DNA <213> SmC4Ll-2斜QF引物序列 <40Q> 12 ATTCGCATTG GCAVTTCTCG G 21 <210>13 <211>21 <2]2> DNA <213> SmC4Ll-405QR 引物序列 <400> 13
[0115] GCGGCGTAGT GCTTCACCTT T 21 <21Q>14 <211>23 <212> DNA <213> SmHPPR-614QF 引物序列 <40Q> 14 TGACTCCAGA AACAACCCAC ATT 23 <21 (?15 <211>20 <2]2> DNA <213> SmHPPR-733QR 引物序列 <400> 15 CCCAGACGAC CCTCCACAAG 20 <21016 <211>25 <212> DNA <213> SmHPPD-735QF 引物序列 <400> 16 CGACCAAGAA CTGGATTATG GfiATT 25 <210>17 <211>21 <212> DNA <213〉:SmHPPD-854QR 弓丨物序列 <400 17 AACTCGGCGA ACTCGTGGAA A. 21
[0116] <210>18 <211>23 <212> DNA <213> SmRAS-648QF 引物序列 <400> 18 CGAGATCGCC TACTCCAAGT TCAA0 25 <210>19 <211>25 <212> DNA <213> SmRAS-865QR 引物序列 <400> 1.9 AGATGGCGTT ACCGAAGTAT C CCTG 25 <210>20 <211>25 <21.2> DNA <Q1S> SmCYP興AH-373QF 弓1 物序到 <400>20 GGTCTGTACC GT( (jTCGTGT TCTCC 25
[0117] <210>21 <211>25 <21.2> DNA <2:13> :SmCYP98A14-544QR 引物序列 <400> 21 ACAMJGCTGG TATTTGGGAA AAGGT 25,,
【主权项】
1. 一种转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 采用基因克隆的方法从丹参中克隆获得SmMYB75基因，所述SmMYB75基因序列如SEQ ID: 1所示； (2) 根据丹参SmMYB75基因序列，把SmMYB75基因可操作性地构建于原核表达的载体，在 大肠杆菌中进行表达； (3) 定量PCR测定并分析SmMYB75在丹参的不同组织中的表达量及其对甲基茉莉酸调控 的诱导表达量； (4) 将SmMYB75基因构建于亚细胞定位的载体，转化根瘤农杆菌，进行烟草叶片的瞬时 转化，对SmMYB75进行亚细胞定位分析； (5) 把SmMYB75基因可操作性地构建于表达调控序列，形成含SmMYB75基因的植物表达 载体； (6) 将步骤(5)所得的含SmMYB75基因的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化 丹参的含SmMYB75基因植物表达载体的发根农杆菌菌株； (7) 利用步骤(6)所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性 的丹参转基因毛状根克隆； (8) 定量PCR测定步骤(7)获得的丹参转基因毛状根中的SmMYB75基因及丹酚酸生物合 成途径中关键酶基因的相对表达量，并筛选出过表达SmMYB75基因的根系中基因表达量提 尚的根系； (9) 高效液相色谱法测定步骤(8)中丹参转SmMYB75基因毛状根中丹酚酸的含量，筛选 丹酚酸含量显著提高的转基因丹参毛状根根系。2. 根据权利要求1所述的转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法，其特征 在于，步骤(2)所述的原核表达的载体为pET-30a( + )，大肠杆菌为菌株Rosetta(DE3)，原核 表达的方法如下： (1) 设计SmMYB75基因原核表达的引物，可操作性的连接原核表达的载体，并转化大肠 杆菌； (2) 将构建成功的重组大肠杆菌Rosetta(DE3)加入IPTG诱导剂诱导表达，进行SDS-PAGE电泳分析。3. 根据权利要求1所述的转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法，其特征 在于，步骤(4)所述的亚细胞定位的载体为pM0N530,根瘤农杆菌为菌株Ase，亚细胞定位的 方法如下： (1) 将含有SmMYB75基因的亚细胞定位的载体转化根瘤农杆菌； (2) 用无菌注射器吸取农杆菌菌液对生长良好的烟草叶片进行瞬时转化； (3) 光照培养，40-48小时后取叶片于载玻片上，背面朝上，用双蒸水浸润，用盖玻片固 定叶片，于激光共聚焦显微镜下观察。4. 根据权利要求1所述的转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法，其特征 在于，步骤(5)所述的植物表达载体为经过改造获得的PCAMBIA2300+载体，包含CaMV35S启 动子和NOS终止子、多克隆位点、复制起始点及卡那霉素抗性位点。5. 根据权利要求1所述的转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法，其特征 在于，步骤(6)所述的发根农杆菌选自菌株C58C1。6. 根据权利要求1所述的转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法，其特征 在于，步骤(7)所述的PCR检测方法如下： (1) 设计发根位点基因 BrolB的特异PCR引物，进行PCR扩增； (2) 插入基因 SmMYB75内部及N0S终止子内部设计上游及下游特异性引物，进行DNA扩 增； (3) 紫外线下观察目的条带，出现目的条带则为阳性转基因丹参毛状根根系。7. 根据权利要求1所述的转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法，其特征 在于，步骤(3)和步骤(8)中所述定量PCR测定方法如下： (1) 对PCR鉴定为阳性的毛状根克隆进行总RNA的提取，统一定量到0.5yg，RNA反转录成 25μ1体系的cDNA; (2) 分别设计插入目的基因及看家基因 SmActin的定量引物，以相同量的cDNA为模板进 行定量PCR分析； (3) 分析SmMYB75及丹酚酸生物合成相关基因的相对表达量情况。8. 根据权利要求1所述的转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法，其特征 在于，步骤(9)所述的高效液相色谱法如下： 色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为体积比30:70的乙腈和水，并用磷酸调节pH至2.03; 检测波长281nm，柱温35°C，流速lml/min，进样量20μ1。
【专利摘要】本发明公开了一种转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法，通过基因克隆的方法从丹参中克隆得到了645bp的SmMYB75基因，构建了SmMYB75基因原核表达和亚细胞定位的载体；构建了植物高效表达载体，遗传转化丹参叶片获得了SmMYB75基因过表达的丹参毛状根，并通过一系列的生物技术的手段筛选得到了丹酚酸含量明显提高的转SmMYB75基因的丹参毛状根。本发明的方法为生产具有重要临床需求的丹酚酸提供了一种新型优质原料，对缓解丹酚酸药源的紧缺性问题具有积极的促进意义和应用价值。
【IPC分类】C12Q1/68, A01H5/00, C12N15/29, C12N15/84
【公开号】CN105602985
【申请号】CN201510713786
【发明人】开国银, 黄芬芬, 朱光明
【申请人】上海师范大学, 上海华宇药业有限公司
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2015年10月28日